[发明专利]一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法

说明书

一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法，属于花卉生物技术领域。该方法对‘西伯利亚’百合遗传转化体系进行了优化。针对‘西伯利亚’百合愈伤组织培养过程中，严重褐化、极易分化不定芽、失去胚性状态的现象，利用变温处理，在保证胚性的基础上，将愈伤组织的继代周期延长至33天以上，为遗传转化提供了稳定、持久的受体材料，大幅度降低转化工作量。在农杆菌侵染和共培养步骤，使用‘羟敌草腈’替代传统的乙酰丁香酮为活化剂，诱导农杆菌Vir区基因表达，使得转化效率提高二倍以上。优化后的遗传转化体系，可用于东方百合的分子遗传改良、种质资源创制、基因工程育种以及百合发育和繁殖等领域的基因功能验证。

技术领域

本发明属于花卉生物技术领域，特别涉及一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法。

背景技术

百合作为重要的观赏、食用和药用植物，其分子生物学研究发展迅速。但是，百合基因组庞大，杂合度高，品种倍性不一、不同杂种系间存在巨大差异，给百合分子育种工作带来的巨大的困难。建立高效、稳定、安全的规范化百合分子育种技术体系是百合基因工程育种亟待解决的问题。

在百合的遗传转化研究中，通常用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法和电击法等方法将外源基因插入到百合的基因组中，其中农杆菌介导的遗传转化是目前百合转基因研究中应用最广、效率最高的转基因方法（Yan et al., 2019）。迄今，仅少数百合实现了高效稳定的基因转化，绝大多数原种和栽培品种缺乏遗传转化体系。

农杆菌介导的单子叶植物遗传转化取决于很多因素，这些因素包括质粒、农杆菌菌株、农杆菌中vir（virulence）基因的激活条件、植物基因型、接种和共培养条件、筛选和再生培养基等（Cheng et al., 2003; Lacroix B and Citovsky V., 2013）。许多科研工作者利用农杆菌介导法对百合的遗传转化进行了研究，分别以百合鳞片（Cohen A andDalla-Favera R., 1992）、叶片（刘菊华 等，2003）、愈伤组织（Wated et al., 1998）、胚性愈伤组织（唐东芹 等, 2003）、体细胞胚（Yan et al., 2019）等为受体材料建立了遗传转化体系。

东方百合杂种系具有茎秆粗大、花茎直立、花大色正、气味芬芳的特点，是世界范围内最受欢迎的切花之一。‘西伯利亚’是我国花卉市场上的百合主栽切花品种，销量很大。一般在设施中栽培，喜温暖，对光强适应性较广，耐弱光，不易落蕾。目前，针对‘东方百合’已经建立了遗传转化体系，但存在转化效率低、周期长且遗传稳定性差等问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法。

发明所采用的技术方案是：一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法，其技术要点是，包括以下工艺步骤：

步骤1，胚性愈伤组织的诱导和保存

将旺盛生长阶段的百合组培苗的小鳞片切成0.5 cm²大小，接种在培养基MS+2.0mg/L PIC+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂中暗培养，培养温度为25±1℃，相对湿度为80-90%，直至形成黄绿色颗粒状明显的愈伤组织；33天转接一次，每次转接时，将愈伤组织与外植体分离并切去褐化部分，在20℃完全黑暗条件下培养；

步骤2， 农杆菌侵染液的制备

挑取携带植物表达载体的农杆菌EHA105单菌落，接种于包含50 mg/L Kan和50mg·L^-1Rif的YEB液体培养基中振荡培养至OD₆₀₀为0.6，5000 rpm离心10 min，收集菌体；取50 mL 含3μM CX的MS液体培养基重悬菌体后，200 rpm重悬液振荡2 h，即为侵染液；

步骤3， 农杆菌侵染和共培养