[发明专利]一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方法及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供了一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，所述质粒标准品包括如SEQ ID NO.1所示的外源基因，将外源基因通过TA克隆方法构建得到质粒，所述质粒能够作为标准品定量检测环境样本中硝化杆菌的含量。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品、构建方法及其应用。

背景技术

环境样品中微生物数量众多且成分复杂。污水处理过程中，硝化细菌是生物脱氮过程的主要功能菌群，可将亚硝态氮转化为硝态氮。亚硝酸盐氧化菌(Nitrite-oxidizingbacteria，NOB)可大致可分为5个类群，硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化刺菌属(Nitrospina)、硝化螺菌属(Nitrospira)、硝化球菌属(Nitrococcus)及最近发现的“Candidatus Nitrotoga”，NOB是利用亚硝氮为氮源，CO₂作为主要碳源的革兰氏阴性菌。硝化杆菌属Nitrobacter可将亚硝酸盐氧化为硝酸盐，在自然界中，Nitrobacter属分布广，主要分布在水产养殖、沉积物、海洋及土壤中，其中最常见的是在污水处理厂中，可用Nitrobacter的16SrRNA进行表征。

PCR技术诞生后，分子生物学和基因工程领域的研究得到巨大进步。PCR技术发展的同时，将PCR产物克隆到载体(通常为质粒)里的技术也获得了新的发展。目前已有多种构建克隆的方法，如限制性内切酶消化连接、不需要连接的克隆、体内连接和位点特异性重组系统等。但这些方法需要用到限制性酶处理PCR产物和载体，或者需要特殊的菌株或某些特殊的酶，因操作复杂且繁琐，难以进行高通量操作。

除上述构建克隆的方法之外，还有两种常用且相对简单的克隆方法：TA克隆和平末端连接。TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3’加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3’端自动添加一个3’-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片段才能通过T/A配对进行连接。而高保真DNA聚合酶通常含有3’-5’核酸外切酶活性，它们扩增出的PCR产物为平末端。将这些片段与切成平末端的载体在T4连接酶的作用下连接就是平末端连接。这两种方法的共同特点是不需要事先用特殊的酶对PCR产物进行处理，而是直接连入载体。

实时定量PCR的分析方法主要分为相对定量和绝对定量。相对定量无恒定的管家基因，难以对目标基因进行标准化。绝对定量较为准确，也是目前环境微生物基因水平定量研究的首选。标准曲线的制备是绝对定量PCR实验的关键步骤，为了研究标准品梯度稀释后进行实时荧光定量PCR的Ct值与模板的拷贝数之间的线性关系是否符合绝对定量的要求。然而，目前缺少定量检测污泥群落中功能菌及其表达基因的标准品，导致检测的效果不准确。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，将亚硝酸氧化细菌的外源基因通过TA克隆的方法插入pGM-T中得到质粒，所述质粒能够作为标准品定量检测环境样本中硝化杆菌Nitrobacter的含量。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于定量检测污泥群落中功能菌的质粒标准品，所述质粒标准品包括如SEQ ID NO.1所示的外源基因。

优选的，所述功能菌为硝化杆菌Nitrobacter。

本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，所述大肠杆菌基因工程菌株含有上述的质粒标准品。

优选的，所述构建方法包括如下步骤：