[发明专利]一种CD4-CD8-NKT细胞制备方法及其应用

权利要求书

1.一种CD4^-CD8^-NKT细胞的制备方法，其中所述的方法包括如下步骤：

1）、胸腺类器官构建

1.1培养皮肤来源成纤维细胞；

1.2培养皮肤来源的角质细胞；

1.3 3D培养：将步骤1.1获得的成纤维细胞与步骤1.2获得的角质细胞结合到细胞外基质ECM的支架上，旋转生物反应器中培养五天，直到细胞在基质上达到汇合，离心收集3D细胞；此步骤离心收集到的3D细胞在结构和功能上都类似胸腺器官，可模拟胸腺环境工作，此步骤收集的3D细胞称为胸腺类器官；

2）、CD4^-CD8^-NKT细胞分选：外周血获得PBMC后利用流式细胞仪分选获得CD4^-CD8^-NKT细胞；

3）、阻滞TNF-α分泌：向步骤2）获得的CD4^-CD8^-NKT细胞添加Lenalidomide；

4）、胸腺微环境驯化CD4^-CD8^-NKT细胞：将步骤1.3得到的胸腺类器官与步骤3）得到的CD4^-CD8^-NKT细胞用无血清免疫细胞培养液重悬，培养；

5）扩增培养并收集CD4^-CD8^-NKT细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的方法获得的CD4^-CD8^-NKT细胞高分泌IFN-γ，阻滞TNF-α分泌以及抑制IL-6的合成。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3）中添加Lenalidomide终浓度为1μM~10μM。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4）的重悬过程之前，还包括利用CD122抗体包被培养瓶的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述的包被具体为用D-PBS溶液将CD122抗体加入培养瓶内，CD122浓度20~100ng/ml，37℃避光包被12小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4）的培养过程还包括在培养瓶中加入5%自体血清、100IU/ml ~1000IU/ml 的IL-27和100IU/ml ~1000IU/ml 的 IL-12，置于二氧化碳培养箱中共培养。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤5）的扩增培养过程中，视细胞生长情况补加含有100IU/ml ~1000IU/ml 的IL-27和100IU/ml ~1000IU/ml的 IL-12的免疫细胞培养液。

8.一种CD4^-CD8^-NKT细胞，其特征在于由权利要求1-7任一项所述的方法制备获得。

9.权利要求8所述的细胞在制备调节免疫功能的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的调节免疫功能是指治疗由于免疫功能紊乱引起的关节疾病。