[发明专利]一种CD4-CD8-NKT细胞制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种CD4‑CD8‑NKT细胞制备方法及其应用，本发明采用皮肤成纤维细胞、角质细胞替代胸腺上皮细胞建立胸腺类器官，驯化CD4^‑CD8^‑NKT细胞，使其只具有免疫调节活性，不具有抗肿瘤活性；阻滞了TNF‑α分泌，使CD4^‑CD8^‑NKT高分泌IFN‑γ，有效的抑制IL‑6、TNF‑α的合成；结果表明上述CD4^‑CD8^‑NKT细胞功能和分泌因子定向，稳定。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种可有效抑制IL-6、TNF-α炎性因子合成的CD4^-CD8^-NKT细胞的制备方法和应用。

背景技术

NKT细胞(CDl d-dependent natural killer-like T cells)作为一类新型的免疫调节细胞，其主要特征为T细胞受体(Tea) 基因表达的恒定性、CDld的限制性以及细胞因子产生的迅速、高水平性。NKT细胞是一群高效的免疫调节细胞，具有保守的高度特异性，NKT细胞具有双向免疫调节特征，可以广泛的调节一系列免疫反应。

肝脏中CD4^-CD8^-NKT细胞主要表现为抗肿瘤活性，而胸腺中CD4^-CD8^-NKT细胞表现为免疫调节的活性，并且产生IFN-γ。而IFN-γ可抑制IL-6的合成。不同的微环境决定了NKT细胞不同的细胞功能。基于FoxN1同时表达于皮肤成纤维细胞、角质形成细胞和胸腺上皮细胞中。胸腺上皮细胞和皮肤成纤维细胞、角质形成细胞都能在角质细胞生长因子的作用下增殖，皮肤角质层的部分角蛋白也与髓质胸腺上皮细胞的赫氏小体相同。本发明采用皮肤成纤维细胞、角质形成细胞替代胸腺上皮细胞建立胸腺类器官，可以避克不同种属生物的免疫排斥。

IL-6 可诱导B淋巴细胞分化和产生抗体，介导类风湿性关节炎（RA）患者产生自身抗体和类风湿因子。在关节囊局部，IL-6 活化内皮细胞使之释放 IL-8 和单核细胞趋化因子，并高表达黏附分子，加强白细胞向炎性部位聚集。IL-6 还可刺激滑膜细胞增殖，加强破骨细胞活性，最终导致关节血管翳形成。IL-6 与 IL-1 共同作用使基质金属蛋白酶产量增加，导致关节软骨的破坏。这是 IL-6 在类风湿性关节炎（RA）发病中的重要机制。而TNF-α介导作用在类风湿性关节炎（RA）疾病发生发展中起重要的免疫调节，血清中异常升高TNF-α可能起主导作用。

研究表明类风湿性关节炎(RA)患者体内的NKT细胞数量比健康人明显减少，而类风湿性关节炎(RA)患者IL-6、TNF-α血清水平明显高于健康人。提高NKT细胞数量并阻断IL-6 、TNF-α合成可减轻类风湿性关节炎(RA)症状。

由于NKT细胞亚群种类多，不同CD1d-NKT细胞激活剂的选择，微环境的影响因素及APC的效率差异都会影响NKT对免疫的调控。不同优化条件，NKT免疫调控不同，分泌细胞因子类型不同，适应的疾病也不相同。目前NKT体外培养不具有精准调控免疫反应，涵盖多型NKT，既有抗肿瘤效应也具有免疫调节活性，同时分泌Th1、Th2、Th1/Th2型多种因子，易造成免疫紊乱。

发明内容

本发明克服现有技术不足，提供了一种可有效抑制IL-6、TNF-α炎性因子合成的CD4^-CD8^-NKT细胞的制备方法和应用。

本发明的第一个方面是提供一种可有效抑制IL-6、TNF-α炎性因子合成的CD4^-CD8^-NKT细胞的制备方法，其中所述的方法包括如下步骤：

1）、胸腺类器官构建

1.1培养皮肤来源成纤维细胞；

1.2培养皮肤来源的角质细胞；