[发明专利]一种用于生物合成增值产品的甲基营养型酵母的无甲醇培养方法

权利要求书

1.一种生产转基因细胞产物的方法，包括：

(a)提供一种表达系统，其包含：包含表达载体的甲基营养型酵母细胞，所述表达载体包含诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子，该诱导型MUT(甲醇利用)途径启动子可操作地链接到核酸分子，该核酸分子编码用于产生感兴趣的转基因细胞产物的感兴趣的重组蛋白；

(b)在合适的碳源上生长甲基营养型酵母细胞，以支持甲基营养型酵母细胞的活跃生长和抑制诱导型MUT途径启动子，从而提供甲基营养型酵母细胞培养物；

(c)在甲基营养型酵母细胞培养物达到合适的甲基营养型酵母细胞培养密度后，在非抑制性碳源上生长甲基营养型酵母细胞培养物，所述非抑制性碳源选自：山梨醇、甘露醇、海藻糖和丙氨酸，从而解除对所述诱导型MUT途径启动子的抑制；

(d)添加一定量的诱导剂化合物，该诱导剂化合物选自以下组，组中包括：S-甲酰基谷胱甘肽；S-羟甲基谷胱甘肽；甲酸；甲酸的碱金属盐；和甲酸的碱土金属盐；足以将所述诱导型MUT途径启动子诱导到所述甲基营养型酵母细胞培养物中，使得所述诱导型MUT途径启动子表达所述核酸分子，该核酸分子编码所述感兴趣的重组蛋白，从而产生所述感兴趣的转基因细胞产物；和

(e)从所述甲基营养型酵母细胞培养物中回收所述感兴趣的转基因细胞产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可诱导MUT启动子选自以下组，组中包括：NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶(FDH)启动子；醇氧化酶2(AOX2)启动子；过氧化物酶Pex14p(PEX14)启动子；二羟基丙酮激酶(DAK)启动子；二羟基丙酮合酶1,2(DAS1,2)启动子；甲酰谷胱甘肽脱氢酶(FGH)启动子；甲醛脱氢酶1(FLD1)启动子；果糖1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)启动子；过氧化物酶体膜信号受体PTS1(PEX5)启动子；乙醇脱氢酶2(ADH2)启动子；和过氧化氢酶(CAT)启动子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲基营养型酵母选自以下组，组中包括：巴斯德毕赤酵母、Komagataella kurtzmanii、Komagataella phaffii、安格斯毕赤酵母、吉列尔莫尔毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、肌醇毕赤酵母、多形汉森酵母、博伊丁假丝酵母和解脂耶氏酵母。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲基营养型酵母为巴斯德毕赤酵母。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测定所述甲基营养型酵母细胞培养密度，以便在足以诱导所述可诱导启动子的浓度上添加所述诱导剂化合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)、(d)和(e)重复多次。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述非抑制性碳源最初分阶段添加到所述甲基营养型酵母细胞培养物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述非抑制性碳源最初分阶段添加到所述甲基营养型酵母细胞培养物中，在耗尽生长所述抑制性碳源之前开始，以便所述甲基营养型酵母细胞培养物最初在所述抑制性碳源和所述非抑制性碳源上生长。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，按照每1L培养物0.001-2.0g的剂量或大剂量添加所述诱导剂，最多为每天20次。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，从所述生长培养基中回收所述感兴趣的转基因细胞产物，并添加额外的非抑制性碳源和诱导剂化合物以维持批处理阶段所述甲基营养型酵母细胞培养物的生长，从而使所述感兴趣的转基因细胞产物继续由所述甲基营养型酵母细胞生产并从所述培养基中回收。