[发明专利]一种用于生物合成增值产品的甲基营养型酵母的无甲醇培养方法

说明书

本文描述了一种生产转基因细胞产物的方法，其中感兴趣的基因可操作地链接到除AOX1以外的可诱导启动子。当宿主细胞在非抑制性碳源上生长以解除对可诱导启动子的抑制时激活转基因细胞产物的产生，且向宿主细胞培养物添加足够量的诱导剂化合物以诱导可诱导启动子，该诱导剂化合物选自：甲醛；S‑甲酰谷胱甘肽；S‑羟甲基谷胱甘肽；甲酸；甲酸的碱金属盐；和甲酸的碱土金属盐。

技术领域

本发明涉及甲基营养型酵母(例如毕赤酵母或Komagataella phaffii)的培养/发酵领域，以生产诸如重组蛋白或小分子化合物的增值产品。

背景技术

甲基营养型酵母，如毕赤酵母，也称为Komagataella phaffii，广泛作为生产重组蛋白的宿主生物。这种酵母利用廉价的底物甲醇作为唯一碳源的能力、其高细胞密度发酵能力、其分泌机制以及强大且严格调控的启动子，使其在生物技术中得到广泛应用。尽管存在强组成型启动子如GAP(甘油醛-3-P脱氢酶)启动子、TEF1启动子(翻译延伸因子)，但是诱导型启动子如AOX1启动子(醇氧化酶)在生产目的方面具有优势，因为它们允许生物质生长而不形成产物。因此，细胞不会因生长过程中重组产物的积累而受到压力，从而实现更好的过程控制。巴斯德毕赤酵母细胞中的AOX1基因在对甲醇的反应中大幅上调，而当培养基中存在葡萄糖或甘油或任何其他可发酵碳源时，它会保持紧密抑制。因此，在所有诱导型启动子中，AOX1启动子使用最多。由任何诱导型启动子驱动的典型生物过程包括葡萄糖或甘油(分批)阶段的生物质生长，然后诱导表达，接着在切换到甲醇(补料和诱导阶段)后产生重组蛋白/化合物。

为了响应不同的碳源，包括AOX1在内的所有诱导型启动子都具有三种受调控的基因表达状态：分解代谢物抑制(或只是抑制)、去抑制和激活(诱导)。对于AOX1启动子，这些状态已得到很好的描述，与本文描述的其他诱导型启动子不同。当培养基中富含甘油或葡萄糖或乙醇或任何其他可发酵碳源时，AOX1启动子被完全抑制。当这些碳源耗尽时，解除了对AOX1启动子的抑制，这意味着它在大约2-5％的甲醇诱导水平下被激活。当培养物在所谓的非抑制性碳源(例如山梨糖醇、甘露糖醇、丙氨酸或海藻糖)上生长时，也可以解除对AOX1启动子的抑制。当培养物开始消耗甲醇作为碳源时，无论有或没有不可抑制的碳源，AOX1启动子和其他列出的启动子都被完全激活(即诱导)，尽管甲醇被广泛用作AOX1驱动诱导系统的诱导剂，在发酵过程中使用甲醇的许多缺点(例如它的易燃性和毒性)极大地限制了该系统在大规模工业规模上的可行性。最近表明，甲酸盐(甲酸盐)几乎可以像甲醇一样诱导AOX1启动子。然而，本文讨论的其他天然启动子是否可以被甲酸或甲酸盐诱导仍然未知。此外，尚未确定甲酸盐或甲酸是否可以与不可抑制的碳源结合用作诱导剂。

发明内容

发酵/培养过程的安全方面应该受到特别关注的主题。就这方面而言，在工业设施中储存大量危险和易燃的甲醇是非常不可取的。除了使发酵过程变得危险和不环保之外，额外安全措施产生的费用可能会使总生产成本增加15％。此外，甲醇代谢导致放热增加，这在技术上是不利的，因为培养消耗大量能量来冷却生物反应器。甲醇代谢的另一个缺点是培养物的耗氧量高，这是很危险的，因为它需要具有高氧容量的生产设施。因此，为了使生物过程更安全、更便宜，从培养过程中排除甲醇是非常有利的，同时保持甚至超过常规AOX1或其他MUT途径诱导基因的高水平表达。目前有一些基于酵母基因修饰的方法，但没有一种方法可以完全避免在已经设计的菌株中使用甲醇。