[发明专利]猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法

权利要求书

1.猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，其特征在于，

包括以下步骤：

步骤1：杆状病毒重组转移载体的构建，具体操作为：

合成猪传染性胃肠炎病毒WH_1株表面刺突蛋白胞外域S1基因；根据锚钩蛋白PA，即乳酸乳球菌MG1363的AcmA序列设计引物PA-F和PA-R以扩增获得PA基因；将S1基因和PA基因进行重叠PCR后，将融合基因S1PA克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1，将PCR、双酶切鉴定正确的重组质粒命名为pFastBac1-S1PA；

步骤2：重组杆状病毒的构建与鉴定，具体操作为：

将步骤1中的pFastBac1-S1PA转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞，利用特异性引物将PCR鉴定正确后的重组杆粒命名为rBacmid-S1PA；利用脂质体介导转染法，将rBacmid-S1PA转染Sf9昆虫细胞，待细胞出现病变，提取细胞基因组进行重组杆状病毒的PCR鉴定，将获得的重组杆状病毒命名为rBV-S1PA；

步骤3：GEM颗粒的制备与鉴定，具体操作为：

将乳酸乳球菌菌液以500倍稀释后，转移至新鲜的M17培养基中培养，将离心收集的菌体洗涤后用10%三氯乙酸重悬，煮沸30min，离心去除酸液，用PBS洗涤五遍后计数，以2.5×10⁹为1U，以10U/mL的浓度，将样品放入真空干燥仪进行中干燥，喷金镀膜后置于透射电子显微镜下观察；

步骤4：表面展示猪传染性胃肠炎病毒S1蛋白细菌样颗粒的制备与鉴定，具体操作为：

收集悬浮培养的Sf9昆虫细胞，超声破碎后经离心去除细胞碎片，与GEM颗粒充分混合室温孵育2h后，将混合液离心收集沉淀，并用PBS重悬，获得表面展示猪传染性胃肠炎病毒S1蛋白的细菌样颗粒；通过SDS-PAGE及Western blot鉴定，并置于透射电子显微镜下观察。

2.根据权利要求1所述的猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，其特征在于，所述S1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PA蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，其特征在于，所述S1和PA基因融合进行重叠PCR所需的上游引物和下游引物序列为：

S1-F：5′-cggaattcatgaagaagctgttcgtggtg-3′；

PA-F：5′-ctttcgtgttcatcaacgtgggagcttcttcagctggaa-3′

PA-R：5′-ccgctcgagttttattcgtagatactgaccaa-3′。

4.根据权利要求1所述的猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤1的具体步骤如下：

步骤1.1：根据SEQ ID NO.2所示的目的核苷酸序列，通过聚合酶链式反应扩增获得PA基因，再根据SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的目的核苷酸序列，以合成基因S1和锚钩蛋白PA基因的PCR产物为模板，利用引物S1-F、PA-R进行重叠PCR获得S1PA基因；

步骤1.2：分别用EcoR I和Xho I对步骤2中获得的S1PA基因进行双酶切并回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶将酶切产物与pFastBac1质粒进行连接，将连接产物通过热激法转化至Escherichia coli DH5α感受态细胞中；

步骤1.3：对所筛选的阳性菌落经扩繁后提取质粒，采用酶切验证及PCR鉴定，以检测S1PA基因是否正确重组至pFastBac1载体中。