[发明专利]猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法

说明书

本发明适用于疫苗研制技术领域，提供了猪用细菌样颗粒（BLP）为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，具体为表面展示猪传染性胃肠炎病毒表面刺突蛋白胞外域S1的乳酸乳球菌BLP的制备方法。该BLP立足于革兰氏阳性增强基质（GEM）‑锚钩蛋白（PA），利用昆虫细胞‑杆状病毒表达系统，构建表面展示猪传染性胃肠炎病毒表面刺突蛋白胞外域S1的细菌样颗粒，该系统具备高度的安全性、抗原展示密度大、具有自体佐剂效应等优点，尤其在黏膜疫苗的研发上可望与病毒样颗粒疫苗一道成为最有前景的基因工程亚单位疫苗；该BLP为猪传染性胃肠炎的疫苗研发提供了技术支持，为猪传染性胃肠炎的防控提供了可行的备选策略。

技术领域

本发明属于疫苗研制技术领域，尤其涉及猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染引起的以仔猪腹泻、呕吐、脱水为主要特征的高度接触性传染性肠道疾病，所有品种和年龄的猪均易感。早在1933年美国就出现关于TGE的记载，1946年首次分离出TGEV。该病在我国的流行形式日趋严峻。临床上常与PEDV、PDCoV及其他病毒混合感染，给猪肠道病毒的防控带来了更大的挑战，严重影响了我国养猪业的发展。目前对于TGEV仍无有效控制手段，因此疫苗免疫是控制该病流行与发展的主要措施。国内应用较多的是常规疫苗（弱毒苗、灭活苗或三联苗），但存在免疫效果不确实和返祖等缺陷。实践证明，肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体（sIgA）是抵抗TGEV感染的有效抗体，而非经口免疫所产生的其它血清抗体，如IgG、IgM对本病的免疫保护效果并不理想。因此选择安全无毒，能够通过黏膜途径传递抗原物质的外源抗原递送系统，进而有效地刺激免疫系统产生黏膜免疫应答，对TGE的防治具有重要意义。

细菌样颗粒的发展为研制生物安全展示系统提供了一种新的方向。该系统包括革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖骨架（GEM）和锚钩蛋白（PA）两部分，分别构成了表面展示系统的载体和运载蛋白。GEM是由食品级乳酸菌经热酸处理，去除原有蛋白质、核酸和脂磷壁酸等物质而只留下细胞壁肽聚糖骨架的空心颗粒，其负载能力远超越母本活菌，外源目标蛋白通过PA锚定到颗粒表面，从而实现外源蛋白在颗粒表面高密度的展示。同时，作为主要成分的肽聚糖为TLR2的配体之一，现已证实BLP通过激活TLR2信号通路，能够诱导宿主树突状细胞（dendritic cell，DC）成熟，成熟的DC分泌IFN-γ、IL-2等炎性细胞因子，从而平衡Th1型和Th2型免疫，激发更有效的免疫应答。BLP的大小和形态与活菌相似，在保证生物安全性的同时能够更好地被上呼吸道M细胞和肠系膜淋巴系统Peyer’s结等捕获，从而有效诱导抗原特异性辅助性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞和B细胞分泌IgA的反应，进而启动局部黏膜和全身系统性免疫应答。

研究表明，TGEV表面刺突蛋白胞外域S1蛋白足以实现相当于全部S蛋白诱导的保护性免疫反应。因此，本发明选取TGEV表面刺突蛋白胞外域S1蛋白基因，以阻断肠道传染性疾病病原感染的第一道防线为目的，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，构建表面展示TGEVS1蛋白的细菌样颗粒，为猪传染性胃肠炎的疫苗研发提供了技术支持。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

猪用细菌样颗粒为载体的猪传染性胃肠炎疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：杆状病毒重组转移载体的构建，具体操作为：

合成猪传染性胃肠炎病毒WH_1株表面刺突蛋白胞外域S1基因；根据锚钩蛋白PA，即乳酸乳球菌MG1363的AcmA序列设计引物PA-F和PA-R以扩增获得PA基因；将S1基因和PA基因进行重叠PCR后，将融合基因S1PA克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1，将PCR、双酶切鉴定正确的重组质粒命名为pFastBac1-S1PA；