[发明专利]一种强杀伤性NK细胞的培养基及体外扩增方法

说明书

本发明公开了一种强杀伤性NK细胞培养基。本发明公开了一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及5‑15μg/mL抗Her‑2单克隆抗体、900‑1100U/mL重组人IL‑2、25‑35ng/mLIGF‑1等，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、900‑1100U/mL重组人IL‑2、25‑35ng/mL重组人IL‑15、5‑15ng/mL重组人IL‑21，继续培养；培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。

技术领域

本发明涉及NK细胞培养技术领域，尤其涉及一种强杀伤性NK细胞的培养基及体外扩增方法。

背景技术

随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透，肿瘤免疫治疗的研究突飞猛进，以免疫学原理为基础、以细胞生物学技术为方法而建立起来的肿瘤免疫细胞治疗，已经从实验室研究逐渐向有效、安全的临床应用过渡。

NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群。NK细胞是机体重要的免疫效应细胞，在抵抗肿瘤和病毒感染等方面起着非常重要的作用。近年来，关于NK细胞及其抗肿瘤功能的研究已经成为免疫学和肿瘤学研究的热点内容之一。

在外周血淋巴细胞中NK细胞含量只有10％左右，NK细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增NK细胞，但上述方法扩增的NK细胞与临床需求仍存在一定的差距。

虫草素又称冬虫夏草素、虫草菌素、蛹虫草菌素，别名3’-脱氧腺苷，目前发现其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种药理活性；目前还未报道其对NK细胞的杀伤活力和增质的影响。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种强杀伤性NK细胞的培养基及体外扩增方法。

一种强杀伤性NK细胞培养基，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和虫草素；人血清白蛋白浓度为8-12g/L，尼克酰胺浓度为2.5-7.5mmol/L，来那度胺浓度为0.5-2.0μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为8-16mmol/L，虫草素浓度为0.1-0.5g/L。

优选地，虫草素和来那度胺的质量比为2000-4000：2.59-4.66。

优选地，尼克酰胺和来那度胺的摩尔比为4500-6500：1-1.8

优选地，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为10-14mmol/L。

一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：

S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；

S2、将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；

继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及5-15μg/mL抗Her-2单克隆抗体、900-1100U/mL重组人IL-2、25-35ng/mL IGF-1、5-15ng/mL OKT-3，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；

S3、每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、900-1100U/mL重组人IL-2、25-35ng/mL重组人IL-15、5-15ng/mL重组人IL-21，继续培养；

S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。

优选地，S2中，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％。

优选地，S2中，抗Her-2单克隆抗体浓度为5-15μg/mL