[发明专利]一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法

说明书

本发明公开了一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法，包括如下步骤：向GT‑T551基础培养基中加入IL‑2、IL‑12、IL‑15、IL‑17、黄芩素、姜黄素、云芝多糖，得到NK细胞培养基；NK细胞培养基中，IL‑2的浓度为500‑600μg/mL，黄芩素的浓度为10‑20μg/mL，姜黄素的浓度为10‑20μg/mL，云芝多糖的浓度为15‑25μg/mL；采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，每隔2天，补加含IL‑2的GT‑T551培养基，培养至第7天，扩瓶培养；培养至第14天，获得高纯度NK细胞。

技术领域

本发明涉及NK细胞体外扩增技术领域，尤其涉及一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法。

背景技术

癌症是现代社会中对人类威胁最大的疾病之一，对癌症的治疗一直是现代医学的关注点。肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。

NK细胞的肿瘤杀伤机制包括：

(1)FasL与Fas相作用，最终启动了靶细胞凋亡系统；

(2)穿孔素/颗粒酶作用，激发凋亡相关酶系统致细胞发生凋亡；

(3)NK细胞表面表达的CD16分子与肿瘤特异性IgG抗体发生结合，从而识别、杀伤与IgG抗体发生特异性结合的肿瘤细胞；

(4)TNF-α、IFN-γ等与靶细胞表面相应受体的结合，启动靶细胞的凋亡系统。

目前一般采用滋养细胞系方法(如使用K562细胞本身作为滋养细胞系)来扩增培养NK细胞，该方法得到NK细胞纯度较高，但由于K562本身就是肿瘤细胞，生产过程中存在安全隐患。

因此，目前研发一种纯度高、扩增倍数高、细胞活率高的NK细胞扩增方法，对于NK细胞大规模临床应用，以提高病人免疫力并杀伤肿瘤细胞是非常重要的。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法。

一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法，包括如下步骤：

S1、向GT-T551基础培养基中加入IL-2、IL-12、IL-15、IL-17、黄芩素、姜黄素、云芝多糖，得到NK细胞培养基；

NK细胞培养基中，IL-2的浓度为500-600μg/mL，IL-12的浓度为300-400ng/mL，IL-15的浓度为40-80ng/mL，IL-17的浓度为120-200ng/mL，黄芩素的浓度为10-20μg/mL，姜黄素的浓度为10-20μg/mL，云芝多糖的浓度为15-25μg/mL；

S2、采集并分离自体外周血的单个核细胞，加入至NK细胞培养基中重悬细胞，加入细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中孵育，每隔2天，补加含IL-2的GT-T551培养基，培养至第7天，扩瓶培养；培养至第14天，获得高纯度NK细胞。

优选地，S1的NK细胞培养基中，黄芩素、姜黄素、云芝多糖的质量比为12-18：13-17：18-22。

优选地，S1的NK细胞培养基中，IL-2的浓度为530-580μg/mL。

优选地，S1的NK细胞培养基中，IL-12的浓度为330-370ng/mL。

优选地，S1的NK细胞培养基中，IL-15的浓度为50-70ng/mL。