[发明专利]应用熔解曲线检测MMACHC基因高频突变的试剂盒

说明书

本发明公开了一种应用熔解曲线检测MMACHC基因高频突变的试剂盒，可以对MMACHC基因高频突变位点c.80AG、c.217CT、c.567dupT、c.482GA、c.658_660delAAG和c.609GA 6个位点的突变情况进行检测，检测成本低，操作简单，准确度高，具有较好的特异性，能够满足临床筛查的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种应用熔解曲线检测MMACHC基因高频突变的试剂盒。

背景技术

甲基丙二酸血症(MethylmalonicAciduria,MMA)，也称甲基丙二酸尿症，是常见的有机酸代谢病。甲基丙二酸和甲基枸橼酸等毒性物质异常蓄积，造成多脏器损伤，尤其是神经系统损伤，严重时常危及生命。该病属常染色体隐性遗传，在全球的发病率约为1:48,000～1:250000，在中国的发病率为1/28004,而在山东省的发病率高达1/3920。该病临床表现个体差异大，可表现为多系统受累，自胎儿时期至成年时期均可发病，容易漏诊、误诊，基因检测是临床分型的可靠依据，早期分子检测和预防尤为关键。

MMA分为单纯型甲基丙二酸血症和甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症两种类型。在中国MMA患者中合并型MMA最常见，合并型MMA包括cb1C、cb1D及cb1F三种亚型，其中以cb1C型为主其编码基因是MMACHC，其中c.80AG、c.217CT、c.567dupT、c.482GA、c.658_660delAAG和c.609GA6个突变位点在临床检出率高，在MMACHC基因中共覆盖大于80％的突变。

目前基因突变常用的检测方法包括：高通量测序法、sanger测序法、高分辨溶解曲线法等。高通量测序法的测序通量大、覆盖度高，但是价格昂贵，操作繁琐，限制了测序速度。sanger测序法作为测序检验金标准，准确度高，但对待测基因组质量要求高和过程操作繁琐、耗时长。高分辨率溶解曲线分析(HRM)法通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变，检测灵敏度高，可检出样品中含量低至1％的突变基因，操作简便快速，使用成本低，结果准确，但该方法多用于检测单基因突变，在多重基因突变检测产品极少。

如何建立一种简便、快速、经济和准确的合并型甲基丙二酸血症基因高频突变筛查方法，为MMA的预防、辅助临床诊断和预后评估提供技术支持，已成为亟待解决的问题。

发明内容

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了MMACHC基因高频突变检测引物对集，所述引物对集包括第一引物对集、第二引物对集和第三引物对集。

在某些实施方式中，所述第一引物对集用于检测MMACHC基因的c.80AG、c.217CT、c.567dupT突变位点。

进一步地，所述第一引物对集包括第一上游引物和第一下游引物、第二上游引物和第二下游引物、第三上游引物和第三下游引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.6所示。

在某些实施方式中，所述第二引物对集用于检测MMACHC基因的c.482GA、c.658_660delAAG突变位点。

进一步地，所述第二引物对集包括第四上游引物和第四下游引物、第五上游引物和第五下游引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.10所示。

在某些实施方式中，所述第三引物对集用于检测MMACHC基因的c.609GA位点。

进一步地，所述第三引物对集包括第六上游引物和第六下游引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示。

进一步地，所述引物对集检测的突变位点信息如表1所示，SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.12的具体序列如表2所示。