[发明专利]CD19突变蛋白及其应用

说明书

本发明提供了一种突变的CD19胞外结构域，所述突变的CD19胞外结构域与亲本CD19胞外结构域的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第82位、第83位、第29位、第184位或第234位；所述第82位氨基酸突变为V，所述第83位氨基酸突变为L，所述第29位氨基酸突变为G，所述第184位氨基酸突变为P，所述第234位氨基酸突变为W。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CD19突变蛋白及其应用。

背景技术

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。其主要原理是，从癌症病人身上分离T细胞，利用基因工程技术为T细胞引入一个能够识别肿瘤细胞并同时激活T细胞的嵌合抗体，也就是制备CAR-T细胞，再将扩增好的CAR-T细胞回输到病人体内，在病人体内进一步扩增，通过增强病人自身免疫杀灭和清除癌细胞。其中CAR，即嵌合抗原受体，是该治疗的核心要素。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的ScFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。其中，肿瘤相关抗原结合区负责识别肿瘤细胞表面抗原，相当于“GPS导航”作用。CAR-T作为一类新的治疗药物，截至目前，在血液肿瘤，比如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，效果显著。尤其以CD19为靶点的CAR-T在急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤里疗效非常显著。目前，FDA批准上市了两款CAR-T细胞药物，分别是诺华制药(Novartis)的Kymriah，和吉利德公司(Gilead)的Yescarta。两款药物均针对CD19阳性B细胞白血病，采用了相同的抗原结合区，即来源于鼠单克隆抗体FMC63的ScFv(single chain antibody fragment，单链抗体)。

在输入病人体内后，CAR-T细胞数目在多数情况下会迅速增加，这是有治疗效果的必要条件。另一个重要判别指标是：在CAR-T细胞输入病人半年后是否还有残存的CAR-T阳性细胞在病人体内；通常没有残存CAR-T阳性细胞会出现疾病复发。

CAR-T细胞作为一种“活的药物”，其制备流程复杂，质控环节众多。首先，由于病毒感染细胞的效率会随不同的病人或其它因素而改变。因此，适当控制回输到病人体内的有效转染细胞的数量是十分重要的一步。过少的有效细胞治疗无效；而过多的有效细胞会导致诸如细胞因子风暴等严重的副作用(有很高的致死率)。因此，准确检测表达CAR的阳性T细胞是CAR-T药物质量控制的关键步骤，也是临床上对病人治疗剂量控制、过程监控及伴随诊断的重要环节。CAR-T靶点蛋白是CAR-T检测的最理想试剂，但CAR-T靶点蛋白结合其对应抗体亲和力都较低，导致临床样本的检测灵敏度低，不能满足临床需求。以CD19 CAR-T为例，CD19与其抗体与其单链抗体的亲和力很低，无法满足检测的需求，需要大幅提高亲和力。同时CD19的稳定性也较差，现有的生物学特性不能成为一个稳定高效的流式检测试剂。另外，CD19是一种B细胞表面的高度糖基化修饰的糖蛋白，在大肠杆菌及酵母等模式细胞中更难表达，我们将通过本实验室建立的高效CHO细胞进化平台，以CD19为模式蛋白，获得高亲和力、高专一性、高稳定性的突变体，满足为CAR-T的临床检测需求。

CAR-T表达阳性率的检测作为CAR-T疗法质量控制的重要一环，目前尚无标准的检测方案。在临床和科研上都需要采用能够用于评价或监测CAR疗法在受试者中的有效性的方法，该方法在受试者回输前及回输后可以准确地区分阳性CAR-T细胞和阴性CAR-T及阳性细胞的活性水平(即单个细胞上CAR的数目)，并且可以和检测CAR-T细胞其它特征的试剂同时使用，不互相干扰，从而为每一位受试者提供精准、有效地治疗，客观准确地评估或监测CAR疗法对受试者的有效性。

目前为止常用的CAR-T阳性率的检测方法有两种类型：检测CAR基因阳性T细胞和检测CAR蛋白阳性T细胞，即PCR检测CAR的拷贝数及流式细胞仪检测CAR-T细胞。