[发明专利]一种从头合成络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种四酶重组表达质粒，其特征在于：所述四酶重组表达质粒包含携带T7启动子的苯丙氨酸解氨酶基因、携带T7启动子的肉桂酰CoA连接酶基因、携带T7启动子的肉桂酰CoA还原酶基因和携带T7启动子的糖苷转移酶基因。

2.如权利要求1所述的四酶重组表达质粒，其特征在于：所述四酶重组表达质粒的载体为pET-28a。

3.如权利要求1或2所述的四酶重组表达质粒，其特征在于：所述苯丙氨酸解氨酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述肉桂酰CoA连接酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述肉桂酰CoA还原酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述糖苷转移酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.如权利要求1所述的四酶重组表达质粒构建的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主菌是对大肠杆菌W3110进行如下改造获得的：敲除tyrR基因、pykF基因、trpD基因和tyrA基因；将galP基因的启动子、glk基因的启动子、ppsA基因的启动子和pheA基因的启动子分别替换为trc启动子；将编码如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的pheA基因突变为如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的pheA^fbr基因；以及将crr基因替换为携带lac启动子的T7RNA聚合酶基因。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于：所述T7RNA聚合酶基因编码如SEQ IDNO:10所示氨基酸序列。

6.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌还含有其它表达苯丙氨酸解氨酶的重组质粒。

7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于：如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于：所述其它表达苯丙氨酸解氨酶的重组质粒的表达载体是pACYC-Duet质粒。

8.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于：所述其它表达苯丙氨酸解氨酶的重组质粒所含苯丙氨酸解氨酶基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

9.如权利要求4所述的基因工程菌在生产络缌中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌接种到含抗生素的LB液体培养基中37℃、180rpm条件下培养12h获得种子液，所述种子液以1％的体积接种量接入新鲜的含抗生素的LB液体培养基，在37℃、180rpm条件下培养至OD600＝0.8时加入终浓度为0.1mM的IPTG，在20℃下诱导培养14h，离心收集菌体，所得湿菌体转入发酵培养基中于30℃、180rpm发酵48h生产络缌。