[发明专利]一种从头合成络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种重组大肠杆菌，以大肠杆菌W3110为宿主细胞，通过代谢工程改造提高络缌关键前体L‑Phe，再过表达来源于粘红酵母的苯丙氨酸解氨酶(RgPAL)、链霉菌的肉桂酰CoA连接酶(Sc4CL)、拟南芥的肉桂酰CoA还原酶(AtCCR)和糖苷转移酶(AtUGT73C5)，实现了络缌(Rosin)的从头合成，该菌株在5L发酵罐分批补料发酵后，产量为4.01g/L，是目前报道的最高产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

络缌((2E)-3-苯基-2-丙烯-1-基β-D-吡喃葡萄糖苷，rosin)又名松香，是L-苯丙氨酸的衍生物，也是最简单的肉桂醇糖苷，络缌可通过糖基化进一步修饰形成络塞维(rosavin)或洛塞琳(rosarin)，这三种化合物一并被称为红景天提取物。络缌具有神经系统保护、抗缺氧、抗抑郁及抗细胞凋亡等多种药理学活性。红景天提取物络缌，主要从景天科红景天属植物大株红景天的干燥根及根茎或干燥全草中提取获得，由于其具有较强的活性，因此吸引了越来越多的注意，随着市场需求的日益壮大，野生红景天被人为大规模采挖，数量急剧下降，从而限制红景天种群本身的维持和发展，另一方面其数量和格局的变化，又严重影响其高寒草甸生态系统，使其稳定性严重下降。随着人们对红景天提取物药理学作用认识的不断深入，需求将继续扩大，如果没有可持续替代的方法合成络缌等提取物，必将导致红景天属植物生物资源的大规模减少和生态系统的进一步破坏。基于此，1999年，Hiroyuki Akita等人以β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)为催化剂在磷酸盐缓冲液(pH＝5)中利用肉桂醇和4-硝基苯基β-d-吡喃葡萄糖苷偶联得到Rosin，但该方法使用疏水醇(肉桂醇)进行酶促糖苷化，使用了大量的醇作为溶剂，且产率较低，仅为11％。2019年，ImanMirmazloum等人通过向红景天愈伤组织喂养不同前体物质生产Rosin，发现当加入2mM反式肉桂酸培养24h可生产92mg/100g DW Rosin，当加入2mM肉桂醛时产量为270mg/100g DW，加入2mM肉桂醇为240mg/100g DW，但远远不能满足工业化生产的需求。

合成生物学的快速发展促使越来越研究人员将生产植物天然产物的目光瞄向了微生物法生产。大肠杆菌(Escherichia coli)是常用的细胞生产工厂，具有生长速度快、易培养，遗传背景清晰，基因操作简单等特点，因此成为了研究最为广泛和深入的模式微生物。2017年Wei Zhou等人通过对大肠杆菌BL21(DE3)生产L-苯丙氨酸竞争途径的敲除获得L-苯丙氨酸生产菌株BPHE，并将苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酰CoA连接酶(4CL)、肉桂酰CoA还原酶(CCR)及糖苷转移酶(UGT)基因在BPHE菌株中过表达，获得Rosin生产菌株BPHE02，摇瓶发酵产量达到258mg/L。2019年Huiping Bi等人在BPHE02菌株基础上过表达长春花糖苷转移酶(CaUGT3)基因，得到BPHE-PDG菌株，最终通过摇瓶培养络缌产量为256.8mg/L，同时获得1107.9±109.2mg/L洛塞维。根据以上研究表明，依靠微生物法工业化生产络缌是一种行之有效的策略，与传统生产方法相比，降低了生产成本，环境污染小，且可持续发展，具有很好的应用前景。但是，现有的合成技术离络缌的工业化生产还有很大距离。因此，提高生物法合成络缌的产量成为必然趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过代谢改造得到无质粒高产L-苯丙氨酸菌株，并以此为基础重组外源基因，获得能够生产络缌的基因工程菌，该基因工程菌能够高产量生产络缌。本发明的第一个目的是提供一种生产络缌的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌以大肠杆菌W3110为底盘菌，通过代谢改造，得到高产L-苯丙氨酸的大肠杆菌WT3菌株。再以大肠杆菌WT3为宿主菌表达来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的苯丙氨酸解氨酶(RgPAL)、链霉菌(Streptomyces aureus)的肉桂酰CoA连接酶(Sc4CL)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的肉桂酰CoA还原酶(AtCCR)和糖苷转移酶(AtUGT73C5)基因。