[发明专利]一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方法，其特征在于，在同一张切片上先进行免疫组织化学双染色，然后进行荧光原位杂交检测，根据免疫组织化学Fast red显色在荧光显微镜下有明亮的红色荧光，而DAB显色在荧光显微镜下没有荧光的特点，精准定位乳腺浸润癌或微小浸润癌的位置。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫组织化学双染色是将乳腺癌石蜡包埋标本切片收在黏附性载玻片上，使用辣根过氧化酶显色系统，选用染色抗体E-Cadherin进行DAB显色，此时乳腺癌细胞浆被染为棕黄色；使用碱性磷酸酶显色系统，选用染色抗体P63、CK5/6进行Fast red显色，此时乳腺导管原位癌周围的肌上皮细胞被染为红色；再用HER-2/CSP17双探针对上述切片进行荧光原位杂交检测。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，免疫组织化学双染色的操作步骤为：

(1)将乳腺癌石蜡包埋标本切片收在黏附性载玻片上，切片的厚度为4μm；

(2)于65℃烤箱内烘烤切片1h；

(3)使用全自动免疫组化染色系统进行免疫组织化学双染色，染色抗体分别为：P63、CK5/6、E-Cadherin。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全自动免疫组化染色系统的染色步骤为：

1)烤片：于75℃烤片4min；

2)脱蜡：脱蜡试剂为Ventana EZ Prep脱蜡液，脱蜡温度75℃，脱蜡时间20min；

3)抗原修复：采用热修复方式，抗原修复液为Ventana CC1抗原修复缓冲液，抗原修复时间为52min，温度为99℃；

4)孵育：使用内源性过氧化物酶抑制剂，于37℃下，孵育4min后，进行清洗；

5)一抗孵育：滴加E-Cadherin抗体100μL，于37℃孵育28min后，清洗去除未结合的一抗；

6)二抗孵育：滴加100μL连有HRP的二抗，于37℃孵育8min后，清洗去除未结合的二抗；

7)DAB显色：滴加DAB试剂和H₂O₂试剂各100μL，于37℃显色8min后，进行清洗，终止显色；

8)变性：升温至94℃，并维持4min，对结合在组织上的一抗和二抗进行变性破坏，防止后续产生交叉反应；

9)第二次一抗孵育：滴加抗体CK5/6和P63各100μL，于37℃孵育24min后，清洗去除未结合的一抗；

10)第二次二抗孵育：先滴加100uL Reaction buffer清洗缓冲液后，再滴加100μL连有AP的二抗，于37℃孵育12min后，清洗去除未结合的二抗；

11)Fast red显色：滴加Naphthol试剂和Fast red试剂各100μL，于37℃显色8min，进行清洗，终止显色；

12)复染：滴加苏木素染液100μL，于37℃孵育12min后，清洗去除未结合的苏木素染料；

13)返蓝：滴加返蓝液100μL，于37℃孵育4min后，进行清洗。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述连有HRP的二抗为ULtraview UniversalDAB试剂盒中的MuLtimer试剂；所述连有AP的二抗为ULtraview Universal AP RED试剂盒中的MuLtimer试剂。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述内源性过氧化物酶抑制剂为ULtraviewUniversal DAB试剂盒中的Inhibitor试剂；所述DAB试剂和H₂O₂试剂来自ULtraviewUniversal DAB试剂盒；所述Naphthol试剂和Fast red试剂来自ULtraview Universal APRED试剂盒。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，清洗时采用喷射式清洗方式，使用pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行清洗。