[发明专利]一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法

权利要求书

1.一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、生防菌的鉴定——通过提取生防菌株的16SrDNA序列，采用细菌的 16S 区通用引物27F/1492R进行16S rDNA序列扩增，并将所得序列结果在ncbi数据库中进行比对分析；

步骤2、平板对峙试验——制备拮抗菌菌饼和炭疽菌菌饼，将炭疽菌菌饼和拮抗菌菌饼分别对称贴于距PDA培养基边缘 2 cm处，恒温培养，以贴有炭疽菌饼和浸泡无菌水的PDA块设为空白对照组，逐日观测菌落生长动态；

步骤3、孢子萌发试验——制备拮抗菌发酵液与梨炭疽菌孢子悬浮液，取梨炭疽菌孢子悬浮液与拮抗菌发酵液混合后，恒温保湿培养，以灭菌超纯水与孢子液混合为空白对照，分别在孵育后用光学显微镜观察拍照并统计孢子萌发率；

步骤4、叶片抑制试验——在托盘底部放置无菌纱布，并用灭菌水浸湿，叶片消毒后针刺处理，放入托盘中，在针刺伤口处滴加拮抗菌菌液与炭疽菌菌饼，用保鲜膜覆盖托盘密封，恒温静置培养后，观测叶片发病情况，以滴加灭菌水后接种炭疽菌菌饼的处理小组为空白对照；

步骤5、果实抑制试验——果实消毒后针刺处理，然后分三组进行处理，第一组在针刺伤口处贴浸泡灭菌水的滤纸，接种炭疽菌菌饼；第二组在每个果实伤口处先贴上浸泡拮抗菌菌液的滤纸，再接种炭疽菌菌饼；第三组在每个果实伤口处先接种炭疽菌菌饼再贴上浸泡拮抗菌菌液的滤纸；接种后果实放置在托盘中，保鲜膜覆盖托盘密封，恒温静置培养，观测果实发病情况，以针刺处理后贴无菌水滤纸的处理为阴性对照，以只接种炭疽菌菌饼为阳性对照；

步骤6、相关防御酶活测定——在叶片和果实抑制试验处理一段时间后，保存植物样本，测定β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶的酶活性。

2.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤1中，16S rDNA序列扩增时，PCR反应的程序为：94℃预变性 3 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，34个循环；72°C终延伸10 min。

3.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤2中，拮抗菌菌饼的制备方法如下：将拮抗菌株在LB培养基划线后恒温培养，然后和PDA培养基活化，恒温培养，取出在超净工作台中用打孔器打取菌饼。

4.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤2、4、5中，炭疽菌菌饼的制备方法如下：将炭疽菌在LB培养基划线后恒温培养，然后和PDA培养基活化，恒温培养，取出在超净工作台中用打孔器打取菌饼。

5.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，所述的步骤3中，梨炭疽菌孢子悬浮液的制备方法如下：用PDB液体培养基摇培梨炭疽菌的菌饼诱导其产生分生孢子，无菌滤布过滤，离心收集分生孢子用PDB液体培养基重悬；

拮抗菌发酵液的制备方法如下：取-80℃保存的生防菌株菌液，在LB培养基中活化，取单克隆菌落于LB液体培养基摇培，过滤得到拮抗菌发酵液。

6.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤4中，叶片选自培养25d的杜梨叶片中部生理状态一致的叶片，针刺位置避开叶脉，滴加菌液20 µL。

7.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤4和5中，消毒方法为：流水冲洗梨叶片和果实，随后使用5% NaClO 溶液浸泡30 s，用超纯水冲洗两次以洗去NaClO溶液残留。

8.根据权利要求1所述一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，所述步骤4和5中，拮抗菌菌液制备方法为：取-80℃保存的生防菌株菌液，在LB培养基中活化，取单克隆菌落于LB液体培养基摇培，用LB培养基调整菌液为OD₆₀₀=0.8。