[发明专利]一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法

说明书

本发明公开了快速鉴定生防菌株对梨炭疽病防治效果的方法，该方法通过梨炭疽病病原菌与生防菌株平板对峙的方法，验证生防菌株对炭疽菌菌落生长的抑制效果；通过离体梨树叶片与果实接种梨炭疽菌与生防菌株，观察不同处理下梨树叶片与果实病情发展来鉴定生防菌株对梨树炭疽病病情发展的抑制效果；通过培养梨树炭疽菌的分生孢子，并初步提取生防菌株的发酵液，验证生防菌株发酵液对分生孢子萌发的抑制效果。本发明具有快速、全面的优点，缩短了生防菌株对梨炭疽病防治效益探究的周期，提高了鉴定结果的准确性，节省了鉴定的人力物力，实现了鉴定的高通量。

技术领域

本发明属于植物抗病性鉴定评价和资源筛选技术领域，具体涉及一种快速鉴定生防菌株对梨炭疽病防治效果的方法。

背景技术

据了解，炭疽菌是植物病原真菌中最常见、最重要的属之一，几乎全世界种植的每一种作物都易受一种或多种炭疽菌的影响。梨树炭疽病，又称苦腐病，主要危害梨树的叶片和果实，初期叶片、果实表面出现一至多个“小黑点”，后逐渐变大，呈现出圆形或不规则形的轮纹状或凹陷状病斑。我国梨炭疽病的病原有12种，且研究发现引起炭疽病的病原种类在不同地理来源、梨系统和梨组织上组成不同，其中C.fructicola为优势种。炭疽病在2007年以前并不算是我国梨产区的主要病害，2008年在中国安徽省砀山县发生严重，造成约1.5亿美元的经济损失，与此同时，由于对于炭疽病防治方法的缺失，上十万亩的梨树因此被砍伐。进一步了解后发现近几年在江西、浙江、安徽、江苏、福建等省份发生的南方砂梨早期落叶也是因为炭疽病菌而造成。

现在世界上针对水果苦腐病最常见和最有效的策略是大量使用化学杀菌剂，最常用的化学类别是醌类外部抑制剂(QOI)和苯并咪唑类(MBCs)。但是滥用化学药剂在导致抗药性菌株发展的同时也会对自然以及人类健康产生负面影响。它们的广泛和密集使用会导致抗药性菌株的发展，并对空气、土壤和水质以及人类健康产生负面影响。如今人们愈发的注重环境保护以及果品农药残的问题，因此，生物防治作为一个环境友好型的防治方法，已成为化学用途的替代品，并已成功应用于收获后的各种水果。生物防治手段防治手段主要包括利用寄生性天敌防治、利用捕食性天敌防治、利用微生物防治。在针对植物病害发生的主要手段是利用微生物防治，通过筛选可以拮抗病原菌生长的细菌、真菌、放线菌等。

采用微生物防治的手段中，具有生防作用的芽孢杆菌占有重要位置，因为多种作用模式和抗应激孢子的形成，增强了它们在不同环境条件下的生存能力，同时芽孢杆菌具有抑菌谱广、安全性高等优点，生防芽孢杆菌被广泛应用到农业生产中。对梨树炭疽病的微生物研究中，刘邮洲等发现生防菌sf 628对梨炭疽病有较好的防治效果；钱鑫蕾等发现甲基型芽孢杆菌可以抑制梨树胶孢炭疽病病原菌菌丝生长和孢子萌发；赵阳等通过比较四种溶杆菌菌株，包括产酶溶杆菌OH11、抗生物溶杆菌OH13、胶溶杆菌OH17和布鲁内森溶杆菌OH23，证明其对炭疽菌系列病原体的拮抗作用；李朝辉等发现奥托威类芽胞杆菌CL01对梨果实炭疽菌的菌丝生长和分生孢子萌发具有较强的抑制作用。芽孢杆菌的种类众多，通过分离不同果园的样本可以筛选到很多有效菌株，同时一种拮抗细菌可以同时对多种病害的病原菌有抑制效果。

然而目前针对梨树炭疽病生物防治菌功能验证的方法较为单一，缺乏系统验证生防菌株对梨炭疽病的防治效果的方法。

发明内容

本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种快速验证生防菌株对梨炭疽病防治效果的方法，该方法操作简单、成本低、速度快、准确性高和适宜梨树炭疽病生物防治菌的功能鉴定。

本发明提供了一种快速验证生防菌株对梨树炭疽病防治效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、生防菌的鉴定——通过提取生防菌株的16SrDNA序列，采用细菌的16S区通用引物27F/1492R进行16S rDNA序列扩增，并将所得序列结果在ncbi数据库中进行比对分析；