[发明专利]一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述的人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1所述的人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备人肠道病毒71型VP1蛋白：以SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为模板，制备氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的VP1蛋白；

S2、生物淘洗：在孔板中加入VP1蛋白和GST蛋白，并接种大肠杆菌菌株和含四环素的培养基，培养；倾去残余液体，加入封闭液，用洗涤液洗涤若干次；加入噬菌体溶液扩增、纯化、洗脱得到洗脱的噬菌体；将洗脱的噬菌体溶液加入大肠杆菌培养物中扩增，分离得到扩增的洗脱液；重复进行第二轮、第三轮筛选，得到筛选出的阳性噬菌斑；

S3、扩增阳性噬菌体：将大肠杆菌培养物稀释，蘸取若干分隔良好的蓝色噬菌斑接种培养扩增；然后离心取上清得到扩增的阳性噬菌体；

S4、编码噬菌体呈现的多肽的DNA序列测定及氨基酸序列推导和氨基酸序列同源性分析；

S5、对筛选出的阳性噬菌体进行ELISA鉴定。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：

S1-1、合成如SEQ ID No.3所示的EV71病毒VP1蛋白的cDNA，扩增EV71病毒VP1蛋白的核苷酸序列，将扩增后的序列连接至pFastBac1载体中，得到重组载体VP1-pFastBac1；

S1-2、将所述重组载体VP1-pFastBac1转化到大肠杆菌DH10Bac中，得到表达VP1蛋白的杆状病毒穿梭载体，选择2个穿梭载体转染Sf9细胞产生一代病毒P1；

S1-3、将步骤S1-2中Sf9细胞的细胞培养上清、细胞裂解上清和经过重悬的细胞裂解沉淀加入到载样缓冲液中混匀、煮沸、离心，取上清进行10％SDS-PAGE凝胶电泳，制备背景清晰的干胶保存；对所述干胶进行Western Blot纯化，得到P1病毒储液；

S1-4、选取感染复数为1～10的P1病毒储液感染Sf9细胞，确定最佳感染复数，选取最佳感染复数的P1病毒储液进行扩大培养得到二代病毒P2；

S1-5、收集P2感染的Sf9细胞的裂解上清，用His60 Ni Superflow Resin对VP1蛋白进行纯化，用含有30mmol/L、50mmol/L、200mmol/L、300mmol/L咪唑的PBS缓冲液分阶段洗脱柱子，收集各浓度梯度洗脱下来的蛋白，对洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析；

S1-6、将步骤S1-5中SDS-PAGE分析结束后的凝胶进行Western Blot鉴定，得到如SEQID No.4所示的氨基酸序列。