[发明专利]一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。该多肽的氨基酸序列为HNWMWYASLPDR。本发明针对现有手足口病诊疗药物特异性不强的问题，以人肠道病毒71型重要衣壳蛋白VP1为靶分子，通过对噬菌体展示随机12肽库进行生物淘洗，获得了一种多肽，通过噬菌体ELISA实验表明，该多肽可以特异性识别和结合EV71病毒VP1蛋白，且分子量小，易于化学合成，免疫原性低。该多肽的成功制备在手足口病诊断、治疗、预防等产品的研发领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及这一种一种人肠道病毒71型VP1蛋白特异性结合多肽及其制备方法和应用。

背景技术

人肠道病毒71型(EV71)是单股正链RNA病毒，从属于小RNA病毒科肠道病毒A属。它是引发手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一，发病时主要表现为发热、腹泻及疱疹性咽峡炎。与典型手足口病不同的是，某些EV71毒株感染可引起重症手足口病，并导致严重的神经系统并发症如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹和神经源性肺水肿等，具有较高的病死率和致残率。EV71发病广泛，已成为全球关注的公共卫生问题。

EV71病毒有A、B、C三种基因型，其基因组全长约含有7500个核苷酸，编码具有2193个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白可以水解为P1、P2、P3三种前体蛋白，这三种前体蛋白可被自身酶系切割为VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白以及2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D七个非结构蛋白。其中，VP4蛋白包埋于病毒外壳的内侧，其余三个结构蛋白均暴露于病毒颗粒表面，直接接触宿主免疫系统；VP1蛋白是EV71重要的衣壳蛋白之一，它决定这病毒的基因型，极易发生氨基酸序列改变，是病毒的毒力决定簇，也是导致患者出现肺水肿的直接原因。因此，VP1蛋白已成为科研工作者重点关注的对象之一。

从手足口病在我国首次出现以来，为了防止病毒流行和降低手足口病爆发的隐患，针对EV71病毒进行的抗病毒药物和疫苗研发从未停止过。我国于2015年12月到2017年5月，先后有3种手足口病疫苗经国家食品药品监督管理总局批准上市，分别是中国医学科学院医学生物研究所的EV71人二倍体细胞疫苗、北京科兴生物制品有限公司的EV71灭活疫苗和武汉生物制品研究所的EV71灭活疫苗。疫苗的预防接种已经大幅度降低了我国手足口病爆发的几率，但是目前仍然存在一些问题需要克服：(1)疫苗接种覆盖率不足以及不是所有人都能对现有疫苗产生良好反应的事实使得研发新型诊断和治疗EV71病毒的药物十分必要，尤其是在遇到大规模感染的时候；(2)EV71病毒具有嗜神经性，目前还不清楚具体的作用机理，严重程度下造成的神经系统疾病能否避免；(3)EV71病毒能够切割参与免疫的蛋白来规避免疫反应，能否克服这一问题也是一个难点；(4)病毒具有潜伏期，大多数情况下发病时已经错过最佳治疗时期，如果能在病毒潜伏期就检测出病毒并有针对性的进行预防和治疗，不但能够降低对患者的伤害，还能降低治疗成本。

因此，制备出能够特异性识别VP1蛋白的多肽，对于EV71病毒的检测和治疗药物的研发具有十分重要的意义。

发明内容

本发明中提供了一种能够特异性识别和结合EV71病毒的VP1蛋白的多肽，该多肽的氨基酸序列为HNWMWYASLPDR。

本发明中还提供了该多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备人肠道病毒71型VP1蛋白：以SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为模板，制备氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的VP1蛋白；

S2、生物淘洗：在孔板中加入VP1蛋白和GST蛋白，并接种大肠杆菌菌株和含四环素的培养基，培养；倾去残余液体，加入封闭液，用洗涤液洗涤若干次；加入噬菌体溶液扩增、纯化、洗脱得到洗脱的噬菌体；将洗脱的噬菌体溶液加入大肠杆菌培养物中扩增，分离得到扩增的洗脱液；重复进行第二轮、第三轮筛选，得到筛选出的阳性噬菌斑；