[发明专利]一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺

说明书

本发明提供一种L‑丙氨酸高效酶转化及提取工艺，包括游离细胞法酶转化反应、脱色、重结晶等步骤，具体操作如下：产L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶的睾丸酮丛毛单胞菌HY‑08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L‑天冬氨酸，加入细胞通透剂EDTA和吐温‑80，加入酶稳定剂磷酸吡哆醛，转化培养，L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶酶活达到55000~70000 U，培养液经过脱色、重结晶、干燥得到成品L‑丙氨酸。

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，涉及一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺。

背景技术

L-丙氨酸（L-alanine， L-Ala）又名 L-2-氨基丙酸，是一种具有重要生理功能的非必需氨基酸，在食品、医药等领域具有广泛的应用。食品应用方面，L-丙氨酸具有甜味与鲜味，被用于食品添加剂，改善食品风味并强化营养，此外其还具有较强的防腐保鲜功能，被用作防腐剂。医药应用方面，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液的组成成分之一，是合成维生素 B5、维生素 B6、L-氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星）和抗癌药 4-羟基水杨醛丙氨酸合锌的前体物质。此外，L-丙氨酸可用于合成具有光学活性的聚合物，在生物医学、液晶、手性催化等领域具有重要的价值。

L-丙氨酸可以通过提取法、化学合成法和生物转化法进行制备。其中，酶法转化是目前工业上的主要生产方法，即利用 L-天冬氨酸-β-脱羧酶（L-aspartate-β-decarboxylase，Asd）以 L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）为原料经脱羧生成 L-丙氨酸。在该工艺中，提高酶转化效率是L-丙氨酸生产工艺中的关键，直接影响L-丙氨酸的提取及得率。同时，由于培养液中含有许多杂质，L-丙氨酸在培养液中结晶，所得L-丙氨酸晶体不仅包含培养基杂质，还会包埋未转化的L-天冬氨酸，使产品质量大打折扣，不能满足高端客户对医药级产品的需求。因此，通过对所得L-丙氨酸酶转化过程及重结晶工艺进行研究，得到了一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺。

发明内容

本发明提供了一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺，提高了酶转化效率和产品的品质，满足了高端客户对医药级产品的需求，值得推广应用。

本发明采用的技术方案是：

一种L-丙氨酸高效酶转化及提取工艺，产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L-天冬氨酸，加入细胞通透剂EDTA和吐温-80，加入酶稳定剂磷酸吡哆醛，转化培养，L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活达到55000~70000 U。培养液经过脱色、重结晶、干燥得到成品L-丙氨酸，得到的L-丙氨酸纯度达99%以上，透光率达98%以上，比旋光度[]_D²⁰为+14.5º~ +15.0º。

其具体操作步骤为：

（1）游离细胞培养液制备

取本单位一株睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株活化并进行高密度发酵培养，获得游离细胞培养液，测定酶活力为45000~58000 U。取1 L游离细胞培养液进行后续酶转化反应。睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的保藏编号为:CGMCC No.6083。

（2）游离细胞培养液活化

向上述游离细胞培养液中加入细胞通透剂，细胞通透剂为EDTA和吐温-80。EDTA的加入量为0.5%~1.5%，吐温-80的加入量为0.05%~0.2%，然后加入L--天冬氨酸-β-脱羧酶稳定剂，稳定剂为磷酸吡哆醛，加入量为0.1~1.0 mM。调整pH为6.0，测定酶活力为55000~70000 U。

（3）酶转化反应

直接向步骤（2）游离细胞培养液中添加固体L-天冬氨酸，采用pH自动控制加液系统，在线监控反应pH值，通过PID控制器自动补加L-天冬氨酸，严格控转化液 pH在5.5-6.0之间，进行酶转化反应。L-丙氨酸的等电点pI=6.02，在整个酶转化过程中L-丙氨酸晶体不断析出，本工艺最终L-天冬氨酸转化率可达400~450%。