[发明专利]甘露聚糖的制备方法与甘露聚糖

说明书

本发明提供一种甘露聚糖及其制备方法，所述制备方法包括步骤：S1：对灭菌后的念珠菌的菌液离心后保留第一上清液；S2：在所述第一上清液中加入无水乙醇，离心后弃去上清，得到甘露聚糖粗提物；S3：将所述甘露聚糖粗提物溶于去离子水后加入十六烷基三甲基溴化铵，离心弃去沉淀，得到第二上清液；S4：调节所述第二上清液的pH至碱性后离心，在所得沉淀中加入酸性溶液，在得到的第一混合物中加入无水乙醇，离心后弃去上清，得到第二沉淀；S5：在所述第二沉淀中依次加入去离子水和由氯仿和醇组成的有机混合液，离心后弃去沉淀，得到多糖溶液；S6：对所述多糖溶液依次进行层析和浓缩，得到甘露聚糖纯品。本发明制备的甘露聚糖纯度较高。

技术领域

本发明涉及抗原制备技术领域，尤其涉及一种甘露聚糖的制备方法与甘露聚糖。

背景技术

念珠菌(Candida)属于隐球酵母科念珠菌属，广泛存在于自然界中，约有300多种，只有少数几种对人体致病，以白色念珠菌最常见，可引起局部或全身感染性疾病，好发于免疫功能低下患者，可侵犯局部皮肤、黏膜以及全身各组织、器官。甘露聚糖是念珠菌细胞壁的重要组成成分，作为念珠菌感染的早期诊断指标。

据不完全统计，全世界每年侵袭性念珠菌感染人数超过250000，造成至少50000例患者死亡(吴昌德等，中国医刊，2018年，第53卷，第6期，585-587页)。我国一项67所医院重症监护室(ICU)的前瞻性调查研究结果显示，ICU侵袭性念珠菌病的发病率为0.32％，以白念珠菌为主，其次为近平滑念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌，白念珠菌病、近平滑念珠菌病、热带念珠菌病和光滑念珠菌病的发病率分别为41.8％、23.8％、17.6％和12.3％(中国成人念珠菌病诊断与治疗专家共识组，中国医学前沿杂志(电子版)，2020年，第12卷，第1期，35-50页)。目前，侵袭性念珠菌感染的患病率有逐年升高的趋势，且念珠菌感染的病死率较高，因此及时进行临床诊断、采取有效的经验性治疗值得重视。蒋月婷等采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中甘露聚糖，其敏感性、特异性比较高，明显优于传统的培养法，因此血清甘露聚糖检测用于临床诊断侵袭性念珠菌病有一定的价值(蒋月婷等，检验医学，2016年，第31卷，第7期，603-606页)。

目前，甘露聚糖抗原主要从念珠菌菌体中分离，采用醇沉的方法得到抗原粗提物，然而，当甘露聚糖抗原用于制备抗体时，由于粗提物中含有蛋白，杂糖等杂质，无法满足抗体制备的要求，现有技术中也有对粗提物进行进一步纯化的研究，例如公开号为CN105866409A的中国发明专利申请公开了将制得的甘露聚糖粗提物用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对粗提物进行进一步纯化。然而，使用该方法步骤并不能得到较高纯度的甘露聚糖，存在其他杂蛋白的干扰。

因此，本领域迫切需要开发一种甘露聚糖的制备方法以解决现有技术中存在的上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘露聚糖的制备方法，制备得到较高纯度的甘露聚糖。

为实现上述目的，本发明的甘露聚糖抗原的制备方法包括以下步骤：

S1：对灭菌后的念珠菌的菌液离心后保留第一上清液；

S2：在所述第一上清液中加入无水乙醇，离心后弃去上清，得到甘露聚糖粗提物；

S3：将所述甘露聚糖粗提物溶于去离子水后加入十六烷基三甲基溴化铵，离心弃去沉淀，得到第二上清液；

S4：调节所述第二上清液的pH至碱性后离心，在所得沉淀中加入酸性溶液，在得到的第一混合物中加入无水乙醇，离心后弃去上清，得到第二沉淀；

S5：在所述第二沉淀中依次加入去离子水和由氯仿和醇组成的有机混合液，离心后弃去沉淀，得到多糖溶液；

S6：对所述多糖溶液依次进行层析和浓缩，得到甘露聚糖纯品。