[发明专利]p-tau181抗原表位肽及其在阿尔茨海默病检测中的用途

权利要求书

1.一种p-tau181抗原，其通过使用双重氮化联苯胺二氯化物法，使人p-tau181抗原表位肽与载体蛋白KLH偶联制备而成；所述人p-tau181抗原表位肽的氨基酸序列为：Ala-Lys-Thr-Pro-Pro-Ala-Pro-Ly s-(p)Thr-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly。

2.根据权利要求1的p-tau181抗原，其是通过使用如下方法制备得到的：将人p-tau181抗原表位肽用PBS缓冲液溶解，将KLH用硼酸盐缓冲液溶解，然后将两者混合，冷却至0℃，加入110μL的双重氮化联苯胺二氯化物，室温下反应1.5h，透析12～15小时，即得。

3.根据权利要求1的p-tau181抗原，其中：

所述PBS缓冲液的配方为：0.2mol/L的Na2HPO4 81ml加0.2mol/L的NaH2PO4 19ml混合而成；

所述硼酸盐缓冲液的配方为：0.05mol/L硼砂80ml，加0.2mol/L硼酸20ml混合而成；

其是通过使用如下方法制备得到的：取人p-tau181抗原表位肽10.0mg，用1ml的0.1MPBS缓冲液(pH7.4)溶解；将10mg的KLH用0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0)20ml溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，加入110μL的BDBCl2，室温下反应1.5h，透析12～15小时，即得；

所述硼酸盐缓冲液用等体积的碳酸盐缓冲液替代，所述碳酸盐缓冲液以如下方式配制：称取2.94g的NaHCO3、1.58g的Na2CO3、0.25g丙酮酸铵、0.12g亚硝酸钠，加水溶解，并用水定容至1000ml，得到浓度为50mM、pH9.6的碳酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1的p-tau181抗原，其中所述人p-tau181抗原表位肽是通过如下方法制备得到的：

步骤1：Fmoc-Gly-树脂的制备

将Rink Amide-MBHA树脂10g置反应器中，加入二氯甲烷，振荡并浸泡，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂，

向以上处理的树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂，

将30mmol的Fmoc-Gly-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，制得Fmoc-Gly-树脂；

步骤2：向上一步骤所得树脂中，加入20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液，室温下振荡进行脱帽反应，去掉氮端Fmoc保护基，抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂，将30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH、HBTU、HOBT加至二甲基甲酰胺中使溶解，加入DIEA，搅匀，移入包含上述经处理树脂的反应器中，室温振荡反应，抽滤除去反应液，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剂，制得Fmoc-Ser(tBu)-Gl y-树脂；

步骤3：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ser(tBu)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤4：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤5：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤6：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Thr(HPO3Bzl)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤7：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤8：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤9：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Ala-Pro-Lys(Boc)-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤10：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Pro-Ala-Pro-Lys(Boc)-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤11：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Pro-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Pro-Pro-Ala-Pro-Lys(Boc)-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤12：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Thr(Trt)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Thr(Trt)-Pro-Pro-Ala-Pro-Lys(Boc)-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤13：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Lys(Boc)-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(Trt)-Pro-Pro-Ala-Pro-Lys(Boc)-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤14：取上一步骤所得树脂和30mmol的Fmoc-Ala-OH投料，参考步骤2的操作方法，制得Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Thr(Trt)-Pro-Pro-Ala-Pro-Lys(Boc)-Thr(HPO3Bzl)-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；

步骤15：肽链的裂解

将上一步骤所得树脂转移至圆底烧瓶，加入预冷切割液(例如95％三氟乙酸/2％TIS/2％EDT/1％水)，室温搅拌反应，抽滤使分取滤液，用三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液和洗涤液，加冰冻乙醚使沉淀，过滤得沉淀物，即为十五肽的粗品；

步骤16：依次使用离子交换色谱系统和高效液相色谱法对上一步骤所得肽粗品进行分离纯化，得肽精制品，即为人p-tau181抗原表位肽。