[发明专利]猪圆环病毒Taqman多重荧光定量PCR检测方法

说明书

本申请提供了一种猪圆环病毒Taqman多重荧光定量PCR检测方法及其相应检测试剂盒，本申请的方法和试剂盒中使用针对PCV1、PCV‑2、PCV‑3、PCV‑4设计的，序列为SEQ ID NO.1‑12的引物和探针。本申请的方法和试剂盒检测对象全面，在一个4重Taqman多重荧光定量PCR中一次性完成检测，且具有良好的灵敏度和特异性。

发明领域：

本申请属于分子生物学检测技术领域，具体地，本申请提供了一种猪圆环病毒Taqman多重荧光定量PCR检测方法及其相应检测试剂盒。

背景技术：

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属的无囊膜单股闭合环状DNA病毒，病毒粒子呈正二十面体对称结构，直径约17-22nm，全基因组大小约1.7-2.0kb，是目前已知最小的动物病毒之一。猪圆环病毒根据其核苷酸同源性的差异又细分为四种基因型，即猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪圆环病毒4型(PCV4)。PCV1最早被发现在1974年，最初被认定是一种PK15猪肾细胞系污染物，但无致病性；PCV2、PCV3分别在1991年和2016年被分离鉴定，均对猪极为易感，临床上常引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy Syndrome,PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)、猪增生性坏死性肺炎(Proliferative and necrotizing pneumonia,PNP)。这些疾病统称为猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)或猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirusassociated disease,PCVAD)；PCV4在我国于2019年在湖南省首次发现，其致病性尚不明确。猪圆环病毒通常引起机体严重的免疫抑制，临床上多呈现多种病原混合感染，对养猪业危害巨大，因此在防治过程中对于该病毒的鉴别诊断尤为重要。

猪只感染不同基因型的猪圆环病毒均有较为相似的临床症状和病理变化，且通常为多种病原混合感染，单纯依靠临床诊断和病理切片很难做出准确判断。因此实验室内分子水平的诊断结果通常被作为金标准进行进一步确诊，即通过分子生物学方法检测病原和通过血清学方法检测血清中和抗体。分子生物学方法主要包括：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和原位核酸杂交试验(ISH)；血清学方法主要包括：酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、免疫组织化学检测(IHC)、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、琼扩试验和胶体金免疫层析检测等。虽然上述方法众多，但目前运用最广泛且研究最多的方法仍为PCR和ELISA方法。现有技术中已经有多种PCV1-3的PCR检测方法。

PCV1-3，特别是PCV2、3的体外诊断技术的研究虽已相对成熟，但关于猪圆环病毒属全部成员，即同时检测PCV1-4型的体外诊断方法却鲜有报道。建立快速有效的PCV1-4型的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法，可以高效、快速检测猪群中早期感染者和隐性带毒者，为掌握PCV流行情况以及后续PCV的防控净化提供帮助，具有重大意义。

发明内容

针对以上情况，一方面，本申请提供了一种非诊断用途的猪圆环病毒Taqman多重荧光定量PCR检测方法，所述方法包括使用以下引物进行Taqman多重荧光定量PCR：序列为SEQ ID NO.1的PCV1-F、序列为SEQ ID NO.4的PCV2-F、序列为SEQ ID NO.7的PCV3-F、序列为SEQ ID NO.10的PCV4-F、序列为SEQ ID NO.2的PCV1-R、序列为SEQ ID NO.5的PCV2-R、序列为SEQ ID NO.8的PCV3-R、序列为SEQ ID NO.11的PCV4-R。