[发明专利]一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法

说明书

本发明提供了一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法，主要涉及内容为一种融合蛋白PULLa‑CBM1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，一种融合蛋白CBM1‑PULLb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述融合蛋白PULLa‑CBM1和融合蛋白CBM1‑PULLb在检测普鲁兰多糖中的应用，本发明提供的融合蛋白PULLa‑CBM1和CBM1‑PULLb能够与普鲁兰多糖特异性结合，并产生荧光，能够用于普鲁兰多糖的检测。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法。

背景技术

普鲁兰糖，又称普鲁兰多糖，1938年最早由Bauer教授发现，通过出芽短梗霉在合适的发酵条件下在体内生物合成，是一种天然胞外多糖。该多糖安全性很高，低热值，稳定性很好，还具有良好的成膜性、阻氧性以及水溶性，在自然状态下不吸湿、无毒、无致癌性、可食用。因普鲁兰糖能形成透明、隔油、隔氧的薄膜，所以可用于空心胶囊壳、食品保鲜、糖果等领域。

普鲁兰糖的检测方法有苯酚-硫酸法、醇沉法、高效液相色谱法等，在普鲁兰糖的发酵生产中，当前广泛使用的检测方法为醇沉干燥法和高效液相色谱法。硫酸蒽酮法测量结果误差较大，重现性不高；每次都要制备标准曲线，操作繁琐；要用到浓硫酸，有一定危险性，对操作人员和设备有较高要求。醇沉干燥法是使用高浓度酒精将发酵液中的普鲁兰糖沉淀出来，然后再高温烘干并称重，由于干燥过程较慢，一般需要8～12h才能完成测定。高效液相色谱法设备要求高，耗材成本高，而且30min之内只能检测一个样品，不适合实验室多水平平行优化实验中普鲁兰糖实时监测。

中国专利文献CN102621269A(申请号：201210098720.7)公开了一种普鲁兰多糖的检测方法，该专利文献公开的定性检测方法是通过薄层层析图谱显色检测普鲁兰多糖，与本申请提供的检测方法明显不同。

目前多数研究针对多样CBM融合碳水化合物酶，以此提高酶分子的催化活性、稳定性以及酶分子与底物的结合特异性，但是利用CBM与荧光蛋白融合作为探针检测底物的方法仍较少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法。

发明人将基因CBM1的N端通过Linker(连接肽)添加PULL基因的a段构建融合蛋白PULLa-CBM1，基因CBM1的C端通过Linker(连接肽)添加PULL基因的b段，构建融合蛋白CBM1-PULLb。本发明发现两个融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb与底物普鲁兰多糖的相邻位点同时发生结合时，能够产生强烈荧光，而融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb不与底物普鲁兰多糖结合时，不产生明显荧光，因此可以利用融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb快速检测普鲁兰多糖。

本专利中构建的CBM1是能够特异性结合普鲁兰多糖的结合结构域。

本发明技术方案如下：

一种融合蛋白PULLa-CBM1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种融合蛋白CBM1-PULLb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，包含上述PULLa-CBM1编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

一种重组载体，包含上述CBM1-PULLb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

一种重组菌，包含上述PULLa-CBM1编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

一种重组菌，包含上述CBM1-PULLb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。