[发明专利]一种能够快速检测β-1，3-葡聚糖的基因构建及应用方法

权利要求书

1.一种融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；

优选的，一种重组菌，包含权利要求1所述融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

3.一种融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；

优选的，一种重组菌，包含权利要求3所述融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

5.一种含融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)合成13GLUCAN1a-CBM2基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)中制得的13GLUCAN1a-CBM2基因片段插入pET-20b(+)载体，得到重组质粒pET-20b(+)-13GLUCAN1a-CBM2；

(3)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(2)制得的重组质粒pET-20b(+)-13GLUCAN1a-CBM2经酶切后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2的大肠杆菌工程菌。

6.一种含融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

①合成CBM2-13GLUCAN1b基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

②将步骤①中制得的CBM2-13GLUCAN1b基因片段插入pET-20b(+)载体，得到重组质粒pET-20b(+)-CBM2-13GLUCAN1b；

③制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤②制得的重组质粒pET-20b(+)-CBM2-13GLUCAN1b经酶切后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b的大肠杆菌工程菌。

7.如权例要求5或6所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)或步骤③中筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。

8.权例要求5所述方法构建的含融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2中的应用；

优选的，权例要求6所述方法构建的含融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b中的应用。

9.由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2和由SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b在检测β-1,3-葡聚糖中的应用。

10.一种检测β-1,3-葡聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白13GLUCAN1a-CBM2、由SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白CBM2-13GLUCAN1b和待测样品混合反应，利用酶标仪检测；

荧光强度增强，则确定待测样品中含有β-1,3-葡聚糖；荧光强度没有增强，则确定待测样品中不含β-1,3-葡聚糖。