[发明专利]一种抗自身免疫药物细胞靶标筛选系统及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统，其特征在于，含有两种筛药细胞株，一种筛药细胞株为稳定过表达人IL-21CNS序列及启动子序列的细胞；另外一种为稳定过表达人Foxp3启动子序列的细胞；所述的两种筛药细胞株均含有双荧光素酶报告基因系统。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的双荧光素酶报告基因系统为含有萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的两种筛药细胞株均为HEK293T细胞。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的人IL-21CNS序列及启动子序列包括：人IL-21CNS2，CNS49和promoter的序列，序列分别如SEQ ID NO：1-3所示；所述的人Foxp3启动子序列如SEQ ID NO：4所示。

5.权利要求1-4任一项所述的抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建稳定表达内参海肾荧光素酶报告基因的293T细胞：将海肾荧光素酶表达慢病毒载体包装成慢病毒，转染293T细胞，进行阳性细胞筛选，得到整合有Rluci的293T细胞；

2)筛药细胞株IL-21CNS+Produal Luci 293T细胞的构建

a)将人IL-21CNS2，CNS49及promoter基因克隆进pLV-pro-luci的慢病毒基因过表达载体Luciferase基因的上游，从而获得重组载体pLV-CNS2-CNS49-IL-21-pro Luci；人IL-21CNS2，CNS49及promoter基因序列分别如SEQ ID NO：1-3所示；

b)将重组载体pLV-CNS2-CNS49-IL-21-pro Luci包装成慢病毒，转染步骤1)中的整合有Rluci的293T细胞；进行阳性细胞筛选，得到IL-21CNS+Produal Luci 293T的稳转细胞；

3)筛药细胞株Foxp3 Produal Luci 293T细胞的构建

a)将人Foxp3 promoter基因克隆进pLV-pro-luci的慢病毒基因过表达载体Luciferase基因的上游，从而获得重组载体pLV-Foxp3-promoter-luci；所述人Foxp3promoter基因的序列如SEQ ID NO：4所示；

b)将重组载体pLV-Foxp3-promoter-luci包装成慢病毒，转染步骤1)中的整合有Rluci的293T细胞；进行阳性细胞筛选，得到Foxp3 Produal Luci 293T的稳转细胞。

6.权利要求1-4任一项所述的抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统的应用方法，其特征在于，

被筛药物和IL-21CNS+Pro dual Luci 293T细胞共同培养后，通过测定该细胞萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平，即以萤火虫荧光素和海肾荧光素的荧光强度比值反映被筛药物对IL-21CNS和promoter表达的影响；

被筛药物和Foxp3 Pro dual Luci 293T细胞共同培养后，通过测定该细胞萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平，即以萤火虫荧光素和海肾荧光素的荧光强度比值反映被筛药物对Foxp3 promoter表达的影响。

7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分别将筛药系统的两种细胞分别种于96孔平底细胞培养板；

单孔细胞量为6000～12000个，每孔含10％FBS的RPMI-1640培养基100～200μl；放于37℃，5％CO₂培养箱中培养12～24h；

2)在细胞培养液中加入待筛选的药物，放于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养24-72h；

3)去除孔内培养液，PBS洗涤后测定两种荧光素酶的活性，评估药效。