[发明专利]一种抗自身免疫药物细胞靶标筛选系统及其构建方法和应用

说明书

本发明建立了一种抗自身免疫药物细胞靶标筛选系统及其构建方法和应用。本发明建立的药物筛选系统是运用分子克隆技术，基于外源重组质粒，将IL‑21的保守非编码序列(Conservative noncoding sequences，CNS)和启动子(Promoter，下文以Pro简称)的部分基因，Foxp3启动子的部分基因分别导入HEK293T细胞内，构建成含有双荧光素酶报告系统的细胞靶标筛药体系。通过测定被筛选化合物抑制导入IL‑21CNS+Pro 293T细胞(IL‑21CNS+Produal Luci 293T)luciferase表达并促进导入Foxp3Pro的293T(Foxp3ProdualLuci 293T)细胞luciferase表达的程度来筛选抗自身免疫药物。本发明所建立的药物筛选体系是一种灵敏、高效、可靠、适于高通量抗自身免疫药物筛选的细胞体系。

技术领域

本发明涉及到一种分别以人IL-21和人Foxp3双靶点的高效、可靠的抗自身免疫药物筛选细胞系统及其构建方法和应用。

背景技术

免疫系统的主要作用是识别和消除外来抗原。当免疫平衡被破坏时，正常的细胞或组织被身体的免疫系统攻击，就会产生自身免疫。自身免疫性疾病主要包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化病等几十余种疾病。

白介素21(IL-21)是一种主要由滤泡辅助性T(Follicular helper T,Tfh)细胞和辅助性T细胞17(T helper 17，Th17)分泌的自分泌细胞因子，在免疫系统中发挥重要作用，例如促进Tfh和Th17细胞的增殖和发育，诱导B细胞生成和分化为浆细胞，促进免疫球蛋白的产生。因此，IL-21与自身免疫性疾病有关。事实上，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、1型糖尿病(T1D)、免疫性血小板减少症(ITP)、原发性干燥综合征(PSS)、自身免疫性甲状腺疾病(AITD)和牛皮癣患者的外周血和组织中IL-21水平都会升高。在SLE和RA中，IL-21的升高甚至与Tfh细胞、浆细胞、自身抗体和疾病活动性呈正相关。此外，IL-21已被用作多种自身免疫性疾病的治疗靶点。IL-21的表达，除了受IL-21启动子的调控外，还受几个保守非编码序列(Conservative noncoding sequences,CNS)的调控，如CNS2，CNS49等。

调节性T(Treg)细胞作为免疫抑制的中枢介质，在免疫系统的许多方面发挥着至关重要的作用，Treg细胞抑制对包括自身抗原在内的多种抗原的过度免疫。转录因子Foxp3被认为是Tregs的关键转录因子，其在Treg细胞的分化、维持和功能中起着关键作用。在人类和小鼠中，Foxp3的缺乏都会导致Treg细胞的缺乏，并导致严重的全身炎症性疾病的发展，表现为自身免疫、结肠炎和过敏。

目前越来越多的研究者意识到以IL-21或Foxp3作为抗自身免疫性疾病药物的靶点，但基于以此为靶点的筛药测量所选用的细胞为原代细胞，操作繁琐且培养过程中需要加入抗体和细胞因子，使得培养成本大大提高。探索更高效更稳定更经济的筛药系统具有重要的现实意义及发展前景。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统，该系统含有两种筛药细胞株，一种筛药细胞株为稳定过表达人IL-21CNS序列及启动子序列的细胞；另外一种为稳定过表达人Foxp3启动子序列的细胞；所述的两种筛药细胞株均含有双荧光素酶报告基因系统。

所述的双荧光素酶报告基因系统为含有萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因。

所述的两种筛药细胞株均为HEK293T细胞。

所述的人IL-21CNS序列及启动子序列包括：人IL-21CNS2，CNS49和promoter的序列，序列分别如SEQ ID NO：1-3所示；所述的人Foxp3启动子序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的第二个目的是提供所述的抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统的构建方法，包括以下步骤：