[发明专利]一种FYCO1-ALK融合基因及其检测试剂盒和应用

权利要求书

1.一种FYCO1-ALK融合基因，其特征在于，ALK基因的融合伴侣基因为FYCO1基因，基因融合突变发生于FYCO1基因的12号外显子与ALK基因的20号外显子之间；FYCO1-ALK融合基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的FYCO1-ALK融合基因，其特征在于，所述FYCO1基因位于3号染色体3p21.31上，位置45917903-45995824，共23个外显子；所述FYCO1 基因的Gene ID:79443。

3.如权利要求1所述的FYCO1-ALK融合基因，其特征在于，所述ALK基因位于2号染色体2p23.2-p23.1上，位置29190992-29921589，共29个外显子；所述ALK 基因的Gene ID: 238。

4.一种检测权利要求1所述FYCO1-ALK融合基因的组合物，其特征在于，包括FYCO1-ALK融合基因、内参HPRT1基因的上游引物、下游引物和探针序列，具体如下：

上游引物FYCO1-E12-F：AAGCGGGAGTTCAGCTGGATGG，其序列如SEQ ID NO.2所示；

下游引物ALK-E20-R ：CTCCATCTGCATGGCTTGCAGC，其序列如SEQ ID NO.3所示；

探针FYCO1-ALK-Probe：FAM-5-CCGGAAGCACCAGGA-3-MGB，其序列如SEQ ID NO.4所示；

上游引物HPRT1-F：5-CAGGCAGTATAATCCAAAGATGGTCA-3，其序列如SEQ ID NO.5所示；

下游引物HPRT1-R：5-GTCTGGCTTATATCCAACACTTCGT-3，其序列如SEQ ID NO.6所示；

探针HPRT1- Probe：VIC-5-TCACCAGCAAGCTT-3-MGB，其序列如SEQ ID NO.7所示。

5.一种检测权利要求1所述FYCO1-ALK融合基因的试剂盒，其特征在于，包括如下成份：

PCR反应液①：权利要求4所述组合物、镁离子、dNTP、去离子水；

PCR反应液②：PCR buffer；

PCR混合酶：Taq酶、逆转录酶、UDG酶；

阳性对照：FYCO1-ALK融合基因的质粒、HPRT1基因的质粒；

阴性对照：去离子水。

6.一种以非诊断和治疗目的检测FYCO1-ALK融合基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样本RNA；

（2）使用权利要求5所述试剂盒，进行荧光定量PCR反应；

（3）根据PCR扩增结果，判断检测结果。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为： PCR反应液①：各引物和探针的浓度均为10 pmol，上游引物共1.0μL、下游引物共1.0μL、探针共0.7μL，25mM镁离子0.5μL，25mM dNTP0.3μL，去离子水30.5μL，共34μL；

PCR反应液②：5X PCR buffer 10μL；

PCR混合酶：5U/μL Taq酶0.5μL、5U/μL逆转录酶0.2μL、5U/μL UDG酶0.3μL，共1μL；

阳性对照：10ng/μL FYCO1-ALK融合基因的质粒、10ng/μL HPRT1基因的质粒，共5μL；

阴性对照：去离子水5μL。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的扩增程序为：第一阶段：42℃、5min，95℃、5min；第二阶段：95℃、25s，64℃、20s，72℃、20 s，10个循环；第三阶段：93℃、25 s，60℃、35 s，72℃、20 s，36个循环；信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和VIC荧光信号。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测结果的判断方法为：

阳性对照的FAM和VIC荧光信号有扩增曲线升起，且Ct值均26，阴性对照的FAM和VIC荧光信号无扩增曲线升起；若阳性对照或阴性对照结果有异常，则需检测实验仪器及实验条件，解决问题后重新检测；

若待测样本的VIC荧光信号有扩增曲线升起，且Ct值≤27；FAM荧光信号有扩增曲线升起，且Ct值≤27，则待测样本有FYCO1-ALK融合基因的突变；

若待测样本的FAM荧光信号的Ct值＞27，则待测样本不含有FYCO1-ALK融合基因或者低于检测下限；

若待测样本的VIC荧光信号的Ct值＞27，则重新提取RNA后再检测。