[发明专利]双功能UDP-糖基转移酶及其应用

说明书

本发明公开了一种双功能UDP‑糖基转移酶及其应用，属于基因工程领域。其双功能是甜菊醇糖苷糖基转移酶和黄酮糖基转移酶。所述糖基转移酶能够在甜菊糖苷的C13/C19位形成β‑1,3‑糖苷键，并且具有C19位偏好性，或在黄酮类化合物羟基上发生糖基化。本发明也提供使用这种重组多肽制备多种稀有甜菊醇糖苷组合物的方法。本发明也公开了被称为莱鲍迪苷E2、甜菊苷B、莱鲍迪苷E6的甜菊醇糖苷。

技术领域

本发明涉及一种双功能UDP-糖基转移酶及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

甜菊糖苷(Steviol glycosides,SGs)是一类从甜叶菊(Stevia rebaudiana)中提取的二萜类天然产物，具有高甜度、低热量等特点，被称为继蔗糖、甜菜糖外的“世界第三糖源”，并且还具有广泛的生物活性，包括抗炎、抑菌以及降血糖等。由于甜菊糖苷及其衍生物价格相对低廉且易于大量提取制备，已被广泛应用于食品饮料、医药和有机化学等领域。

目前已分离鉴定了超过60种二萜甜菊糖苷，总糖苷含量占叶片干重的15％-20％。甜菊苷(Stevioside，STV)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，Reb A)是甜菊糖苷的主要成分，约占叶片干重的5-10％和2-4％，甜度是蔗糖的150-250倍，具有一定的苦涩后味。莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，Reb D)和莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，Reb M)的甜度约是蔗糖的350倍，甜味阈值低，且几乎不具有苦涩后味，但其含量仅占叶片干重0.4％-0.5％，高昂的纯化成本降低了Reb D/M商业应用的价值。

在Reb M的生物合成通路中，需要利用具有β-1,3-糖基化功能的UDP-糖基转移酶(Uridine-diphosphate dependent glycosyltransferases,UGTs)在Reb D的C19位的第一个葡萄糖C3位上连接一个新的葡萄糖，此前认为UGT76G1在该过程中发挥功能，但是体外实验表明，UGT76G1在该过程中催化效率较低。在甜叶菊中过表达UGT76G1也不能提高Reb M的累积量。因此，开发高效制备的Reb D/M的方法，对开拓甜菊糖苷市场尤为重要。

另外，具有C19位β-1,3-糖苷键的甜菊糖苷，如Reb AM，含量远低于具有C13位β-1,3-糖苷键的甜菊糖苷，如Reb A，表明具有C19位偏好性的β-1,3-糖基转移酶的研究缺失。

挖掘具有C19位偏好性的β-1,3糖苷键糖基转移酶，解决C19位糖基化效率低的瓶颈，不仅有利于Reb M的制备，也有助于合成新型或稀有甜菊糖苷，丰富甜菊糖苷甜味剂库，实现廉价甜菊糖苷向高附加值糖苷的高效转化，提升甜菊糖苷竞争力。

在植物中，UGTs能立体特异性或空间特异性的转移一个UDP活化的糖到一类受体分子上。其中，GT1家族的糖基转移酶的受体分子是植物次级代谢物，包括抗生素、酚类、黄酮类、生物碱和萜类。研究表明UGTs具有广泛的底物耐受性，但也具有一定底物特异性，即糖基化结构相似的多种物质。

目前文章或专利报道的双功能糖基转移酶主要分为两类，一类双功能体现在供体底物识别多样性，即能够利用不同的供体糖；另一类双功能体现在糖基化类型多样，即C-、O-或S-的糖基化。甜叶菊中尚未发现能够糖基化不同类别受体底物的UGTs。

黄酮类化合物是植物中广泛分布的一大类次级代谢物，结构多样且部分具有抗癌、抗炎等重要的药理活性。黄酮糖苷类天然产物是植物中黄酮类化合物的主要存在形式，糖基化提高这些化合物的生物活性、稳定性、水溶性等，使植物能迅速应对生物或非生物胁迫。多种黄酮糖苷有重要的药用价值。寻找甜叶菊体内的能够实现黄酮糖基化的UGTs，能够得到更多的黄酮糖基化工具酶，有利于制备新型黄酮糖苷。能实现黄酮和萜类物质糖基化的双功能UGTs的挖掘也为UGTs底物识别机制解析提供了材料基础。

发明内容