[发明专利]一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域；所述试剂包括基于CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别元件、超支化杂交链式反应信号放大反应用试剂和比色分析用试剂；本发明以CRISPR/Cas12a为特异性识别元件，自催化后引发超支化杂交链式反应并形成n层分支的DNA纳米结构，并在DNA纳米结构上构建多维G‑四链体‑血红素DNA酶矩阵，从而实现多重信号放大，完成对牛结核分枝杆菌‑DNA的超灵敏检测。本发明对牛结核分枝杆菌DNA具有较高的特异性选择，检出限为8.9aM(LOD＝3σ/S)，实现了对牛结核分枝杆菌DNA的超灵敏检测。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法。

背景技术

牛结核分枝杆菌是结核分支杆菌复合体(MTBC)的成员，结核分支杆菌复合体是一组在多种哺乳动物中引起结核病的遗传相关分支杆菌物种。在所有MTBC成员中，牛结核分枝杆菌的宿主范围最广，可导致家畜、家禽、野生动物和人类患上牛结核病，此疾病的一般特点是潜伏期长，并对环境、经济等方面产生不可忽略的影响。

目前，检测牛结核分枝杆菌的方法主要有：微生物培养、免疫学方法、分子检测等。其中，微生物培养和免疫学方法可以检测牛结核分枝杆菌感染，但它们对亚临床或潜伏期感染的敏感度和特异性较低，并且微生物培养还存在孵育时间长和检测工作量大的问题。分子检测主要采用PCR技术，PCR技术虽然显著提高了检测性能和效率，但是其检测灵敏度较低，易存在假阳性和假阴性的结果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测牛结核分枝杆菌的试剂、试剂盒及检测方法，本发明具有高灵敏度和高特异性。

本发明提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂，包括基于CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别元件、超支化杂交链式反应信号放大反应用试剂和比色分析用试剂；

所述基于CRISPR/Cas12a正反馈循环机制的识别元件包括：gRNA-T、Cas12a蛋白、辅助探针和可切换导向RNA；

所述可切换导向RNA由iDNA-spacer、iDNA-handle和gRNA组装得到；

所述gRNA-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述辅助探针为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经碱基互补配对组成的双链；

所述iDNA-spacer的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述iDNA-handle的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述超支化杂交链式反应信号放大反应用探针包括H1、SH1、H2、L1、L2和SH2；所述H1、H2、SH1、SH2、L1和L2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.12所示；

所述比色分析用试剂包括氯化血红素、H₂O₂和ABTS。

优选的，所述iDNA-spacer、iDNA-handle和gRNA的摩尔比为：(1.1～1.3)：(1.1～1.3)：1。

本发明还提供了一种检测牛结核分枝杆菌的试剂盒，包括上述方案所述的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照品包括SEQ ID NO.23和SEQID NO.24所示的核苷酸序列碱基互补配对组成的目标序列。