[发明专利]一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用。首先分别合成了侧链接枝了甲基丙烯酰基团以及酰脲基嘧啶酮基团的明胶衍生物，Gel‑MA和Gel‑UPY；配制两种明胶衍生物的水溶液，并与光引发剂充分混合后制成凝胶的成胶溶液；随后经过冷冻、紫外光照、融化过程制备得到了冷冻大孔凝胶。所得的冷冻大孔凝胶具有相互连通的大孔结构以及良好的力学性能，可以有效促进组织细胞的迁入，在骨软骨缺损再生领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物凝胶技术领域，具体涉及一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用。

背景技术

关节软骨具有承重和低摩擦的特点，它能够帮助关节部位顺畅地运转。过度负重或者过高频率的使用关节，会增加关节软骨损伤的风险。关节软骨的损伤会引发关节疼痛、活动受限甚至导致残疾。

通过现有的临床治疗方法，骨软骨缺损通常只能再生出纤维化的软骨样组织，其在结构和功能上与天然透明软骨仍有很大不同。近年来，基于支架的组织工程策略成为促进骨软骨缺损完全再生的一种重要手段。其中，无细胞支架基于生物相容性好的天然和合成材料为内源性细胞提供适宜其生长的3D微环境，与载细胞支架相比其制备和储存简便，免疫原性低，更易临床转化。

无细胞（或因子）水凝胶支架面临的问题是水凝胶的纳米级凝胶网络结构不利于物质交换和细胞浸润，从而阻碍原位骨软骨再生。如何制备一种既能有效促进组织细胞的迁入，同时又具有良好的力学性能的无细胞水凝胶支架是有待解决的技术问题。

发明内容

本部分的目的在于提供一种明胶制备方法，使其具有大分子孔洞的同时还具有优秀的机械强度，从而达到软骨修复，促骨再生的目的。本部分概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明提供一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法，由以下步骤组成：

步骤1，合成侧链接枝甲基丙烯酰基团的Gel-MA：将明胶溶解，调节pH值，滴加甲基丙烯酸酐进行反应，终止反应后，将产物加入到冰乙醇中沉淀、离心，将离心后的产物溶解在水中，透析，冻干，得到Gel-MA；

步骤2，合成侧链接枝酰脲基嘧啶酮基团的Gel-UPY：将六亚甲基二异氰酸酯和2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶加入到反应瓶中，惰性气体保护下冷凝回流反应，沉淀产物，减压抽滤，将得到的滤饼真空干燥得到2（6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺）-6-甲基-4[1H]嘧啶酮；惰性气体保护下将明胶溶解，得到明胶溶液，将所述2（6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺）-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶解得到2（6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺）-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液，将所述2（6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺）-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液加入到所述明胶溶液中，在室温下反应，将所得产物在异丙醇中沉淀离心，将离心后产物溶解，透析，冻干，得到Gel-UPY；

步骤3，将Gel-MA、Gel-UPY以及苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂依次溶解在水中配制为成胶溶液，其中，所述Gel-MA的质量分数为4~6%、所述Gel-UPY的质量分数为4~6%、所述苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂的质量分数为0.5~1 ‰，将所述成胶溶液置于冰箱中放置1~2 h后，从冰箱取出置于紫外灯下光照30~90秒，将得到的凝胶置于37 ℃中，得到冷冻大孔凝胶。

作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案：步骤1中，所述将明胶溶解，为将明胶溶解在PBS缓冲液中，70℃加热搅拌溶解，所述明胶的质量体积分数以g:mL计为10 %，

作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案：步骤1中，所述调节pH值，为45 ℃下用NaOH调节溶液pH为8.0。