[发明专利]一种6-Me生物碱在抗肿瘤中的应用

权利要求书

1.一种6-Me诱导死亡抑制胰腺癌恶性表型的生物学活性研究，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1测定细胞浓度

将胰腺癌细胞系，即Patu-8988、PANC-1、ASPC-1及CFPAC-1，接种于96孔细胞培养板中，次日，加入浓度梯度6-ME进行处理48hr，按10μL/孔加入CCK-8试剂，37℃孵育2hr，于450nm测定OD值，并绘制细胞活力曲线，计算不同时间点的IC₅₀；

S2测定细胞生长

将上述胰腺癌细胞系接种于RTCA细胞培养板中，培养过夜，加入相应浓度的6-ME进行处理，测定细胞生长曲线；

S3细胞克隆实验

将细胞按1000细胞/孔接种于六孔板中，于37℃细胞培养箱中进行培养，待长出肉眼可见的克隆细胞团后，加入浓度梯度6-ME进行处理，完成后，将细胞应用甲醇于室温进行固定15min，接着用结晶紫染色液于室温染色20min，后用去离子水漂洗，进行拍照并计数；

S4测定细胞死亡

收集vehicle和6-ME处理后的胰腺癌细胞，用预冷的PBS重悬后收集细胞沉淀，加入适量AnnexinV-PE/7-AAD染料进行染色，于流式细胞仪进行分析，着重分析细胞在各象限中的分布情况。

2.一种6-Me激活RIPK1/Caspase进而诱导细胞死亡的关键作用，其特征在于，具体包括以下步骤：

①测定作用浓度初步明确6-ME可能介导的程序性细胞死亡PCD

将胰腺癌细胞系Patu-8988及CFPAC-1接种于96孔细胞培养板中，次日，加入6-ME以及其他程序性细胞死亡PCD抑制剂，共培养24hr，按10μL/孔加入CCK-8试剂，37℃孵育2hr，于450nm测定OD值，分析6-ME可能介导的死亡方式；

②测定相关指标

收集vehicle和6-ME处理后的胰腺癌细胞，应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白质浓度，并结合Western Blot检测细胞死亡相关指标的变化，着重分析PARP、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9等分子的活化水平；

③测相关信号轴指标

收集vehicle和6-ME处理后的胰腺癌细胞，应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白质浓度，并结合Western Blot检测RIPK1-MLKL信号轴相关指标的变化，着重分析p-RIPK1、p-MLKL的变化；

④测共培养后指标

收集vehicle，6-ME处理以及6-ME与NEC-1共培养后的胰腺癌细胞，应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白质浓度，并结合Western Blot检测细胞死亡相关指标的变化，着重分析PARP、Caspase-3、Caspase-8的活化情况；

⑤流式测细胞死亡

收集vehicle，6-ME处理以及6-ME与NEC-1共培养后的胰腺癌细胞，用预冷的PBS重悬后收集细胞沉淀，加入适量AnnexinV-PE/7-AAD染料进行染色，于流式细胞仪进行分析，着重分析细胞在各象限中的分布情况。