[发明专利]一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法

权利要求书

1.一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将人类牙周炎炎症牙龈组织冲洗、剪碎、离心去上清，获得组织沉淀；

将所述组织沉淀采用I型胶原酶和Dispase II进行酶解消化，获得混合溶液，后终止消化并采用过滤网过滤收集滤液，经离心，获得第一细胞沉淀；

向所述第一细胞沉淀中加入红细胞裂解液，静置后离心去除上清，清洗后离心，获得第二细胞沉淀；

向所述第二细胞沉淀中加入死细胞去除磁珠进行孵育，获得含磁珠细胞悬液；将所述含磁珠细胞悬液置于磁柱过滤，后收集滤液经离心获得第三细胞沉淀并重悬，获得牙龈组织单细胞悬液。

2.根据权利要求1所述的一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述冲洗采用预冷的含5％青霉素和链霉素的无钙镁PBS溶液；所述剪碎中剪至0.2～0.4mm³的组织小块。

3.根据权利要求1所述的一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述I型胶原酶和所述Dispase II预先溶解于α-mem培养基中获得含酶培养基，且所述I型胶原酶和所述Dispase II工作浓度分别为5～7mg/ml和7～9mg/ml；将所述组织沉淀采用所述含酶培养基进行酶解消化。

4.根据权利要求3所述的一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述组织沉淀与所述含酶培养基的体积比为1：9～11。

5.根据权利要求1所述的一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述酶解消化中，采用37±0.5℃水浴消化50～80min，期间每隔5分钟震荡重悬组织沉淀。

6.根据权利要求1所述的一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述终止消化中，使用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的α-mem培养基，使用体积为所述混合溶液的体积的3～5倍。

7.根据权利要求1所述的一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述细胞滤网孔径为40微米。

8.根据权利要求1所述的一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述红细胞裂解液的体积与所述第一细胞沉淀的体积的比值为95～105：1。

9.根据权利要求1所述的一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述死细胞去除磁珠的体积与所述第二细胞沉淀的体积的比值为18～22：1，所述加入死细胞去除磁珠进行孵育的时间为10～30min。