[发明专利]一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法

说明书

本发明公开了一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，所述方法包括：将人类牙周炎炎症牙龈组织冲洗、剪碎、离心去上清，获得组织沉淀；将所述组织沉淀采用I型胶原酶和Dispase II进行酶解消化，后终止消化并采用过滤网过滤收集滤液，经离心，获得第一细胞沉淀；向所述第一细胞沉淀中加入红细胞裂解液，静置后离心去除上清，清洗后离心，获得第二细胞沉淀；向所述第二细胞沉淀中加入死细胞去除磁珠进行孵育，获得含磁珠细胞悬液；将所述含磁珠细胞悬液置于磁柱过滤，后收集滤液经离心获得第三细胞沉淀并重悬，获得牙龈组织单细胞悬液。该方法无需专业化设备和技能，耗时短即可获得大量的高活性单细胞悬液。

技术领域

本发明涉及细胞悬液培养技术领域，特别涉及一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法。

背景技术

牙周炎是由细菌介导的发生于牙周组织的慢性炎症性疾病。其临床表现为牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收。如果不经治疗，最终导致牙齿丧失。2017年第四次全国口腔健康调查结果显示，我国90％成年人均患有牙周病，35-44岁、55-64岁和65-74岁年龄组人群牙周炎患病率分别为52.8％、69.3％和64.6％，表明牙周炎的防控形势较为严峻。

近年来，单细胞RNA测序技术已被广泛应用于探讨疾病与健康状态下组织中的不同细胞群体数目、基因表达水平以及相关功能的变化，帮助研究人员从单个细胞层面研究疾病的致病机制。把组织消化解离为高质量的单细胞悬液(细胞活力80％以上)是单细胞RNA测序的首要前提。目前，大多数分离牙龈组织单细胞悬液的方法，如组织块法和胶原酶消化法，存在耗时长，细胞数目少，细胞活力低，细胞结团率高等缺点，尚不适用于进行单细胞RNA测序。

因此，为解决上述技术问题，有必要开发一种牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，克服以往制备牙龈组织单细胞悬液方法的缺点，促使单细胞RNA测序技术在牙周炎研究中的应用。

发明内容

本发明目的是提供一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，该制备方法无需专业化设备和技能，耗时短即可获得大量的高活性单细胞悬液。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种人牙周炎牙龈组织单细胞悬液的制备方法，所述方法包括：

将人类牙周炎炎症牙龈组织冲洗、剪碎、离心去上清，获得组织沉淀；

将所述组织沉淀采用I型胶原酶和Dispase II进行酶解消化，获得混合溶液，后终止消化并采用过滤网过滤收集滤液，经离心，获得第一细胞沉淀；

向所述第一细胞沉淀中加入红细胞裂解液，静置后离心去除上清，清洗后离心，获得第二细胞沉淀；

向所述第二细胞沉淀中加入死细胞去除磁珠进行孵育，获得含磁珠细胞悬液；将所述含磁珠细胞悬液置于磁柱过滤，后收集滤液经离心获得第三细胞沉淀并重悬，获得牙龈组织单细胞悬液。

进一步地，所述冲洗采用预冷的含5％青霉素和链霉素的无钙镁PBS溶液；所述剪碎中剪至0.2～0.4mm³的组织小块。

进一步地，所述I型胶原酶和所述Dispase II预先溶解于α-mem培养基中获得含酶培养基，且所述I型胶原酶和所述Dispase II工作浓度分别为5～7mg/ml和7～9mg/ml；将所述组织沉淀采用所述含酶培养基进行酶解消化。

所述I型胶原酶和所述Dispase II工作浓度分别为5～7mg/ml和7～9mg/ml的原因是消化效率高，如果选择其他工作浓度有消化效率低，消化不彻底的不利影响；

进一步地，所述组织沉淀与所述含酶培养基的体积比为1：9～11。

进一步地，所述酶解消化中，采用37±0.5℃水浴消化50～80min，期间每隔5分钟震荡重悬组织沉淀。