[发明专利]一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用

说明书

本发明构建了高效表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的工程菌，该工程菌中包含构建的重组表达载体和共表达载体，所述重组表达载体包含表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因和组成型启动子HCE基因，所述共表达载体包含分子伴侣蛋白的基因，所述分子伴侣蛋白包括dnaJ、dnaK、GroEL和grpE。本发明通过替换启动子更高效的进行表达，并使D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶与分子伴侣共表达，有效减少包涵体蛋白的形成，分子伴侣进行辅助折叠形成四聚体高级结构，提高表达出可溶蛋白的效率，从而提高D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的表达水平，降低制备成本。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用。

背景技术：

阿洛酮糖又称D-阿洛酮糖，为D-果糖三号位碳所对应的差向异构体，阿洛酮糖具有与蔗糖相似的口感，但其甜度相当于蔗糖的70%，热量相当于蔗糖的0.3 %，且几乎不在体内代谢。并且由于可以通过抑制葡萄糖的吸收来抑制葡萄糖，因此具有降血糖的功效，是最具潜力的蔗糖替代品之一。

阿洛酮糖天然存在于葡萄干、无花果、猕猴桃和红糖等食物中，是自然界中含量极少的稀有单糖，依靠天然产物提取的方法成本高，且很难达到量产。现有技术中，制造D-阿洛酮糖的方法中有化学方法和生物方法。如比利克(bilik)等人曾研发利用钼酸离子的催化作用来由果糖生产阿洛酮糖的技术。麦克唐纳(mcdonald)通过对1,2:4,5-二-o-丙酮缩甘油-β-d-果糖进行三步骤化学处理过程来生产了阿洛酮糖。

但化学方法会产生大量的副产物和使用大量化学试剂，且生产效率并不高。近年来，生物方法制备阿洛酮糖以其安全、绿色、环保的优势而逐渐成为未来的主流趋势。早期，肯·伊兹莫里(kenizumori)等人证实了利用微生物细胞反应以半乳糖醇、d-塔格糖或d-塔罗糖醇为原料生产阿洛酮糖，但原料不易取得，成本高。经过前人的不断研究，现阶段的生物转化法主要是以果糖为原料，经D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化合成D-阿洛酮糖，该方法催化合成效率较高，是目前合成阿洛酮糖的主要方式。

如申请号为201710124243.X公开的一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用，其中记载的D-阿洛酮糖3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，并且该D-阿洛酮糖3-差向异构酶用于在工业上催化生产阿洛酮糖，或用作工业上催化生产阿洛酮糖的催化剂。

但由于来源于野生菌株未经改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶在热稳定性、催化活性等方面存在一定的局限性，导致酶的应用成本偏高，限制了其工业应用范围。现有技术常通过改造菌体来提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化活性，如申请号为201610818847.X公开的一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用，该专利提供了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体，含有G86D、D164E、W262S突变位点中的一个或多个突变位点，催化活性得到显著提高，催化活性为野生型的1.4倍以上，降低了合成D-阿洛酮糖过程中的酶的用量。

虽然现有技术通过突变等方式提高了酶的催化活性，但仍然存在用大肠杆菌或芽孢杆菌表达蛋白时有大量包涵体蛋白，表达出可溶蛋白效率较低的问题。且由于阿洛酮糖与果糖的差价较低，因此制备阿洛酮糖的关键因素在于酶的制备成本。基于此，如何构建出高效可溶性表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌株成为低成本制备阿洛酮糖的关键点。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明构建了高效表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，该工程菌中包含构建的重组表达载体和共表达载体，提高了表达出可溶蛋白的效率，从而提高了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达水平。

本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：

发明提供的技术方案之一，是提供重组表达载体，所述重组表达载体包含表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子HCE基因。