[发明专利]一种快速简便的果胶酶活性检测方法

说明书

本发明涉及果胶酶活性检测技术领域，公开了一种快速简便的果胶酶活性检测方法，包括待测样品处理阶段，该阶段包括，S1、反应：果胶酶对果胶分解反应获得溶液I；S2、扩散：溶液I在滤纸上扩散并测距获得扩散距离。本方案根据反应后的溶液在滤纸上的扩散结果即可检测果胶酶的活性，其设备简单、用材简单，使得本方案检测更方便、成本更低。同时，本方案所用检测方法的灵敏度更高(定量限为0.005单位)、检测范围更广(0.005‑0.160单位的线性范围)，使得本方案可广泛应用于各种果胶酶活性检测场景。

技术领域

本发明涉及果胶酶活性检测技术领域，具体涉及一种快速简便的果胶酶活性检测方法。

背景技术

植物细胞壁由多种蛋白质和含有碳和氮的复合多糖组成，包括纤维素、半纤维素和果胶，它们作为物理屏障防止外来微生物入侵。果胶酶(PG，亦称多聚半乳糖醛酸酶)是由细菌、真菌和酵母菌等不同微生物自然产生的一种水解酶，作用于果胶的聚半乳糖醛酸，使α-1,4-糖苷键断裂，促进果胶的降解感染宿主组织。在微生物感染宿主组织的早期阶段，PG对于不具有任何特定穿透结构的病原微生物至关重要；果胶酶含量的测定对于预测微生物感染宿主组织具有重要的作用。此外，PG也因其越来越多的生物技术应用而引起业界的极大兴趣，从果汁和葡萄酒的提取澄清到天然纤维的浸解、咖啡和茶的发酵、废水处理和棉花生物精炼等，均涉及对果胶酶的应用。因此，检测PG活性不仅能对宿主组织是否感染微生物进行预测，还能对植物的各种应用打下理论基础，为追求作物高产的农民、追求高品质产品的消费者等均具有重要指导意义。

目前用于测定PG活性的常规方法是粘度测定法和比色法。其中，粘度测定法为利用连接到检测器系统的粘度计来比较酶促反应前后溶液粘度的变化。然而，粘度测定法需要昂贵的粘度计和熟练的操作员，且因为其检测结果为范围值，准确性较低，使得在测量过程中需要重复清洗和校准，非常麻烦。再者，粘度测定法还需要较长的测定时间和较高的试剂/样品体积消耗，使得检测成本非常高。另外，比色法则是基于PG作用于果胶过程中产生的还原糖末端数量的变化而检测果胶酶活性。常用的比色法有二硝基水杨酸试剂法、砷钼酸铜试剂法、钌红染料法等。这些比色法均为基于显色材料前体与还原糖反应产生响应色而检测酶活性，如二硝基水杨酸与还原糖反应产生橙色3-氨基-5-硝基水杨酸产物、砷钼酸铜与还原糖反应生成蓝色钼蓝产品等。然而，比色法仍然存在如下缺点：(1)样品中自身具有高还原力的物质和其他酶均会影响显色，从而干扰PG的测定，进而使得测结果不准确；(2)样品中本身存在的大量还原糖会严重影响由PG产生的少量还原糖的检测，从而干扰低水平PG的测定；(3)实验取用的有色样品也会干扰显色，从而影响PG检测的显色判断，从而降低PG活性检测的准确率；(4)比色法检测方法需要较长的测定时间、大量的试剂和样品以及多步骤的分析过程，使得检测成本高、流程复杂、结果准确率较低，对检测方法的使用场景非常局限。因此，迫切需要开发一种简便、便携、经济高效、灵敏度高、选择性好的PG快速检测方法，可以有效弥补现有PG检测方法的不足，对以PG活性检测为基础的诊断、检测具有重要意义。

发明内容

本发明意在提供一种快速简便的果胶酶活性检测方法，以解决现有果胶酶活性检测成本较高的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种快速简便的果胶酶活性检测方法，包括待测样品处理阶段，该阶段包括，S1、反应：果胶酶对果胶分解反应获得溶液I；S2、扩散：溶液I在滤纸上扩散并测距获得扩散距离。

本方案的原理是：

依据不容浓度的果胶酶分解果胶而得的产物溶液粘度不同，且不同粘度溶液在滤纸上的扩散结果不同的原理，本方案将果胶溶液经不同活性果胶酶标准溶液水解，获得不同粘度的反应溶液，再将不同粘度的反应溶液在滤纸上扩散得到不同扩散结果的滤纸，最后通过对不同扩散结果的滤纸进行定量分析以检测果胶酶的活性。

本方案的优点是：