[发明专利]一种快速检测人外周血Her2基因扩增的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测人外周血Her2基因扩增的方法。本发明基于CRISPR/Cas9系统中gRNA在dcas9的引导下可与特定DNA序列结合的原理，设计靶向Her2基因和LAF4基因的探针gRNA序列，将标记上不同荧光的gRNA探针与dcas9蛋白反应结合，组成探针体系，通过酶标仪显示Her2基因与内参基因的荧光值结果，实现对人外周血Her2基因扩增的快速检测，具有灵敏度高、特异性好、快速、经济、操作方便等优点，可用于通过血液ctDNA检测进行乳腺癌辅助诊断，临床以及预后等多个研究领域。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及 Her2基因扩增检测的方法。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位列我国女性恶性肿瘤的第1位和第4位。中国每年新发乳腺癌26.9万例，死亡7.0万例，45-59岁女性为高发年龄段人群，中位年龄为50岁。2021年1月初，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布了2020年全球癌症负担数据，统计显示，2020年，女性乳腺癌新增人数达226万，首次超过肺癌，成为全球第一大癌症，约占新发癌症病例的11.7%

Her2基因即人类表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth FactorReceptor 2）基因，Her2位于17号染色体，主要编码Her2蛋白。Her2蛋白是一种跨膜糖蛋白，在细胞增殖、分化、血管生成等过程中发挥重要作用，其高表达可加速细胞分裂，使其增殖、分化过程失衡，最终转变为癌细胞。此外，有研究发现Her2高表达可增加肿瘤细胞的迁移率、体外侵袭率和Ⅳ型胶原酶活性，且可干扰黏附分子合成，从而促进肿瘤侵袭、转移和复发。

目前，在医学诊断上，Her2基因是诊断乳腺癌的关键基因标记物，Her2基因扩增阳性或过表达的乳腺癌患者在治疗模式与其他类型的乳腺癌患者有很大的区别，是靶向用药的重要依据，研究显示，在Her2基因阳性的乳腺癌妇女中，赫赛汀作为单药治疗、联用标准化疗或在标准化疗后使用，均可以提高治疗效果。同样Her2也可以作为肺腺癌、结肠癌等的诊断指标，而且对于后期治疗有很重要的指导意义。

CRISPR-Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，CRISPR-Cas9是基因组调控技术中灵活性最强的系统之一。Cas9 的核酸酶剪切活性取决于两个结构域RuvC 和HNH，这两个结构域分别负责切割 DNA链的两条链，并且这两个结构域能够单独地被人工点突变失活。当 RuvC 和HNH 同时处于失活状态时(D10A＆H840A; RuvC-＆HNH-)，Cas9将不具有核酸酶活性，成为 dCas9(deadCas9) ，dCas9 虽然没有剪切 DNA 的能力，但仍可以在 gRNA 的引导下与特定DNA序列结合,在微量DNA靶标的检出上具备快速、便捷、特异性好、灵敏度高的优势。

目前，临床上检测Her2扩增的常用检测方法有免疫组化（IHC）、荧光原位杂交（FISH）、荧光定量PCR（qPCR）和测序（NGS）。IHC是基于抗体在蛋白水平上的检测手段，虽已被广泛应用，但受组织固定、抗原修复、一抗的灵敏度和特异度、染色结果评定等多种因素的影响，尤其对Her2轻、中度表达的样本造成假阴性；FISH是基于探针直接在DNA水平上的检测，是病理检测金标准，但FISH对探针制备的要求很高，存在检测周期长和实验室条件的限制；另一方面，IHC和FISH通常需要获得病理组织，取样方式给病人造成了一定的痛苦和伤害。另有研究显示，人外周血中可检测到与乳腺癌细胞一致的基因扩增，但常用的qPCR检测手段针对人外周血循环肿瘤DNA此类微量样本，检测结果不够灵敏；NGS虽然结果相对比较准确，但是检测成本较高，造成大量病患得不到及时准确的诊断而失去个体化用药的机会。

发明内容

为了解决上述问题，提出了本发明，以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的用于外周血中Her2基因扩增的快速检测方法及试剂盒。