[发明专利]重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种重组慢病毒载体和293T‑CD3细胞系及其构建方法与应用。该重组慢病毒载体包含CD3D、CD3G、CD3E和CD247表达盒；其中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247各分子间以2A肽编码核酸分子相连，并在3′端连接真核抗性基因；且CD3D、CD3G、CD3E、CD247和真核抗性基因位于同一表达盒内。本发明还提供一种基因改造的293T‑CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T‑CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR‑慢病毒的滴度奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

293T细胞是由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。同时，293T细胞容易被VSV-G包膜的慢病毒转导，因此293T细胞广泛应用于慢病毒的包装。

慢病毒是细胞工程领域的主要传递载体，但目前还没有统一的慢病毒滴定的标准。目前最常规的慢病毒滴度的方法是使用qPCR来估计前病毒拷贝的数量，该前病毒已经整合到了滴定细胞的基因组中。

当293T细胞用于检测表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，如果按照传统的qPCR法通过估计前病毒拷贝的数量来测定病毒滴度的话，由于存在TCR基因可能无法表达的情况或者是TCR能够表达但无法呈递到细胞表面的情况，会导致检测到病毒滴度与实际的病毒存在较大差异，从而限制了293T细胞在该领域中的应用。

因此，有必要对滴定表达TCR的慢病毒的方法进行进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种基因改造的293T-CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T-CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR-慢病毒的滴度奠定了基础。

第一方面，本发明提供一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子；其中，各编码核酸分子间以2A肽编码核酸分子相连；且CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子位于同一表达盒内。

本发明中，CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子在所述表达盒中的连接顺序没有特别的限制，只要表达后能够组装成完整的CD3分子即可。根据本发明一种优选的实施方式，在所述表达盒中，CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子从5’端到3’端按顺序依次连接。

本发明中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247的核苷酸序列可以为CD3D、CD3G、CD3E和CD247的公知序列，优选分别如SEQ ID No.1-4所示。