[发明专利]核酸分子、同源重组载体、转基因动物及其构建方法以及动物体内细胞标记方法

权利要求书

1.一种核酸分子，其特征在于，包括：

5’同源臂、3’同源臂以及位于5’同源臂和3’同源臂之间的融合蛋白编码序列，

其中，所述融合蛋白编码序列记作DreER，其核酸序列如SEQ ID NO:1第3067-5076位核苷酸所示，

所述5’同源臂核酸序列如SEQ ID NO:1第1-3000位核苷酸所示，

所述3’同源臂核酸序列如SEQ ID NO:1第5968-8967位核苷酸所示。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，还包括：

一段2A序列，位于所述5’同源臂和所述融合蛋白编码序列之间，用于使所述融合蛋白编码序列与其上游相邻的调控基因分开单独表达，所述2A序列的核酸序列如SEQ ID NO:1第3001-3066位核苷酸所示。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，还包括：

Wpre序列，位于所述3’同源臂和所述融合蛋白编码序列之间，用于增强所述融合蛋白编码序列的表达效果，所述Wpre序列的核酸序列如SEQ ID NO:1第5080-5667位核苷酸所示。

4.一种同源重组载体，其特征在于，包括：

权利要求1-3中任意一项所述的核酸分子，

所述同源重组载体通过无缝克隆技术构建而成。

5.一种转基因动物，其特征在于，包括：权利要求1-3中任意一项所述的核酸分子。

6.一种构建转基因动物的方法，其特征在于，包括：

步骤一，获取Cas9 mRNA和gRNA；

步骤二，构建同源重组载体；

步骤三，将所述Cas9 mRNA、所述gRNA以及所述同源重组载体显微注射到动物的受精卵中，获得F0代动物；

步骤四，将鉴定阳性的所述F0代动物与野生型动物交配，繁育获得F1代动物，鉴定阳性的F1代动物为Vgll4-DreER基因定点敲入动物。

7.根据权利要求1所述的构建转基因动物的方法，其特征在于：

其中，所述动物为小鼠。

8.根据权利要求7所述的构建转基因动物的方法，其特征在于，还包括：

步骤五，将Vgll4-DreER基因定点敲入小鼠与Dre-rox同源重组报告基因小鼠R26-rRFP交配，得到Vgll4-DreER；R26-rRFP双基因型小鼠。

9.根据权利要求7所述的构建转基因动物的方法，其特征在于，还包括：

步骤六，将Vgll4-DreER基因定点敲入小鼠与双同源重组报告基因小鼠R26-lrRFP交配，得到Vgll4-DreER；R26-lrRFP双基因型小鼠，然后将所述Vgll4-DreER；R26-lrRFP双基因型小鼠与组织细胞特异的A-CreER小鼠交配得到A-CreER；Vgll4-DreER；R26-lrRFP三基因型小鼠。

10.一种动物体内细胞标记方法，其特征在于，包括：

向权利要求8所述的Vgll4-DreER；R26-rRFP双基因型小鼠或权利要求9所述的A-CreER；Vgll4-DreER；R26-lrRFP三基因型小鼠注射他莫昔芬后，即可启动同源重组过程，将Vgll4阳性的某类细胞都永久标记上红色荧光。