[发明专利]核酸分子、同源重组载体、转基因动物及其构建方法以及动物体内细胞标记方法

说明书

本发明提供了一种核酸分子、同源重组载体、转基因动物及其构建方法以及动物体内细胞标记方法，核酸分子具有这样的特征，包括：5’同源臂、3’同源臂以及位于5’同源臂和3’同源臂之间的融合蛋白编码序列，其中，融合蛋白编码序列记作DreER，其核酸序列如SEQ ID NO:1第3067‑5076位核苷酸所示，5’同源臂核酸序列如SEQ ID NO:1第1‑3000位核苷酸所示，3’同源臂核酸序列如SEQ ID NO:1第5968‑8967位核苷酸所示。Vgll4‑DreER通过同源重组技术切除报告基因小鼠(如R26‑rRFP小鼠)中两个同向rox序列之间的STOP序列来永久标记VGLL4阳性的细胞。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种核酸分子、同源重组载体、转基因动物及其构建方法以及动物体内细胞标记方法。

背景技术

Cre同源重组酶基因编码区序列全长1029bp，由343个氨基酸组成的38kDa单体蛋白。能特异识别DNA序列上的loxP位点，使loxP位点间的基因序列被删除或重组。loxP序列来源于P1噬菌体，由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了loxP的方向。Cre-loxP同源重组系统是在多种模式生物，尤其是小鼠中，广泛应用的遗传学操作系统。Cre重组酶能够识别loxP DNA序列并进行DNA序列插入、删除和反转操作。

利用这一特点，人们在构建小鼠时将loxP位点引入小鼠DNA序列中，得到floxed小鼠，再将Cre小鼠与floxed小鼠交配，产生的后代体内，Cre重组酶会与loxP位点发生作用，导致基因重组，Cre-loxP系统常用于基因的条件型敲除或者重组删除两个同向loxp之间的STOP cassette来启动后面报告基因的表达，来达到永久标记某类细胞的目的。与此同时，除了Cre-loxp同源重组系统外，多种特异位点重组酶系统，例如Dre-rox、Flp-frt等在噬菌体等生物中被发现，使多同源重组系统的开发成为可能。

Hippo信号通路是进化上相对保守的一条信号通路，在控制器官大小，调节细胞增殖，凋亡，干细胞命运等方面具有重要功能。VGLL4作为Hippo信号通路的一个新成员，能够与转录辅因子YAP竞争结合转录因子TEADs，从而抑制YAP-TEADs转录复合物的活性，实现对生长发育的调控。VGLL4在各组织器官中的功能近年来正在如火如荼进行。研究VGLL4基因功能的基础，首先就是建立VGLL4在各组织器官发育过程中的表达谱。然而，由于VGLL4没有可用于免疫荧光染色的抗体，我们构建了表达VGLL4-eGFP融合蛋白的报告基因小鼠，通过检测GFP的信号，来反映VGLL4的细胞定位。我们已利用此小鼠清晰阐明了VGLL4在不同发育时期心脏瓣膜中的表达谱,并报道了VGLL4在瓣膜发育过程中的重要功能。但是对于一些VGLL4表达量比较低的组织和细胞，由于GFP信号也相对较弱，很难清晰明确地确定Vgll4的表达情况。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种核酸分子、同源重组载体、转基因动物及其构建方法以及动物体内细胞标记方法。

本发明提供了一种核酸分子，具有这样的特征，包括：5’同源臂、3’同源臂以及位于5’同源臂和3’同源臂之间的融合蛋白编码序列，其中，融合蛋白编码序列记作DreER，其核酸序列如SEQ ID NO:1第3067-5076位核苷酸所示，5’同源臂核酸序列如SEQ ID NO:1第1-3000位核苷酸所示，3’同源臂核酸序列如SEQ ID NO:1第5968-8967位核苷酸所示。。

在本发明提供的核酸分子中，还可以具有这样的特征，还包括：一段2A序列，位于5’同源臂和融合蛋白编码序列之间，用于使融合蛋白编码序列与其上游相邻的调控基因分开单独表达，2A序列的核酸序列如SEQ ID NO:1第3001-3066位核苷酸所示。