[发明专利]香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法

权利要求书

1.一种香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，以各处理组香蕉果皮的混合样品作为样品材料，香蕉基因组作为对照，进行两个独立生物学重复的DAP-Seq实验，鉴定MaNAC25和MaNAC28蛋白在香蕉全基因组水平上的结合位点。

2.根据权利要求1所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，所述DAP-Seq实验包括以下步骤：

S1、提取香蕉果皮的基因组DNA；

S2、将基因组DNA进行片段化处理和纯化处理后，测序构建基因组DNA文库；

S3、将冷响应转录因子的编码序列克隆到表达载体中构建融合蛋白，捕获表达的蛋白质；

S4、将蛋白质与衔接子连接的基因组DNA片段结合，重悬后进行PCR反应，纯化和筛选PCR产物并重悬，洗脱的DNA片段进行测序建库。

3.根据权利要求1所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，包括步骤S5、将DAP-Seq测序读段映射到香蕉基因组序列，检测相对于基因组对照的MaNAC25和MaNAC28的富集峰，分析MaNAC25和MaNAC28目标基因的富集基序。

4.根据权利要求3所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S5具体包括：使用BOWTIE2将DAP-Seq测序读段映射到香蕉基因组序列；使用MACS 2.0检测相对于基因组对照的MaNAC25和MaNAC28的富集峰，并用IGV进行富集峰可视化分析；使用Homer分析位于2.5kb以内转录起始位点上游或下游的DAP-Seq峰的关联；使用BEDTools获得FASTA序列进行基序分析；使用MEME-Chip Suite 5.0.5分析MaNAC25和MaNAC28目标基因的富集基序，以获得保守的基序序列图标和相应的评分值。

5.根据权利要求3所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，包括步骤S6、以MaNAC25和MaNAC28在两个生物学重复实验中的重叠峰为分析对象，发现MaNAC25和MaNAC28与基因组各区域片段结合。

6.根据权利要求5所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S6中基因组各区域片段包括启动子、3'-非翻译区、5'-非翻译区、外显子、内含子和其他基因间片段，MaNAC25和MaNAC28在香蕉全基因水平上的结合位点主要分布在启动子区域。

7.根据权利要求1所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，包括步骤S7、进行基序富集分析，获得MaNAC25的DNA基序和MaNAC28的DNA基序。

8.根据权利要求7所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S7具体包括：在已鉴定的MaNAC25和MaNAC28结合域的DNA基序中进行搜索，并利用MEME-ChIP软件进行基序富集分析，获得MaNAC25的DNA基序和MaNAC28的DNA基序。

9.根据权利要求7所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S7获得的MaNAC25的基序为[C/T]A[C/A]G[C/T/G][A/C/T][A/T]和[T/G/C]C[T/C/G][T/C][T/C][C/T]T[C/T][T/C][C/T]。

10.根据权利要求7所述的香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S7获得的MaNAC28的基序为CG[G/A/C]CG[G/A]C、C[T/G/A]CC[T/A/G]CC和CT[T/G]CTNC。