[发明专利]香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法

说明书

本发明提供了一种香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，以各处理组香蕉果皮的混合样品作为样品材料，香蕉基因组作为对照，进行两个独立生物学重复的DAP‑Seq实验，鉴定MaNAC25和MaNAC28蛋白在香蕉全基因组水平上的结合位点。本发明基于DAP‑Seq方法鉴定香蕉果实MaNAC25和MaNAC28在全基因组水平上的结合位点，该检测方法成本低且能够快速获取大量转录因子蛋白全基因组结合位点信息，为MaNAC25和MaNAC28响应冷胁迫的转录调控机制研究提供了重要依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法。

背景技术

越来越多的证据表明，通过结合基序分析工具和启动子结合测定方法，每个NAC转录因子可能具有特定且不同的结合基序。在植物生长和发育过程中，不同NAC转录因子可能通过响应不同的内部和外部信号而具有不同的特异性结合基序，为NAC转录因子调控的靶标基因提供了更多选择性。

ChIP-Seq是将深度测序技术与ChIP实验相结合分析全基因组范围内DN A结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法。ChIP-Seq检测方法具有高灵敏度、强灵活性、高分辨率等优点，已广泛应用在拟南芥等植物中用于深入说明植物转录调控机制。然而，ChIP-Seq实验实施难度大，并依赖于抗体质量且对稀有或低表达蛋白具有高度选择性，并且受多种因素影响，包括染色质质量、DNA修饰以及与DNA结合的蛋白质的稳定性。因此，许多非模式植物物种因遗传背景差异大及抗体难制备等因素很难利用ChIP-Seq技术深度分析转录因子蛋白在全基因组上的结合位点。

NAC转录因子MaNAC25和MaNAC28在香蕉果实耐冷性中起到负调控因子的作用，探究其响应不同信号的特异性结合基序具有重要意义。但香蕉富含糖、淀粉、维生素以及大量的蛋白质等营养物质，且组织内蛋白质分布在各个细胞器，彻底分离出核蛋白有一定的难度；并且香蕉果实作为呼吸跃变型果实，在常温下逐渐成熟，在低温下易发生冷害，且果肉和果皮成分存在差异，当内部组织响应外界不同的环境时而发生不同的变化，因此很难利用ChIP-Seq技术检测香蕉果实内转录因子蛋白在全基因组上的结合位点。因此亟需开发一种香蕉果实MaNAC25和MaNAC28在全基因组上结合位点的鉴定方法，这对于研究NAC转录因子响应冷胁迫的转录调控机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定香蕉果实MaNAC25和MaNAC28在全基因组水平上的结合位点的方法，挖掘MaNAC25和MaNAC28响应冷胁迫时的特异性结合基序。

为解决上述技术问题，本发明提供一种香蕉果实的冷响应转录因子在全基因组上结合位点的鉴定方法，以各处理组香蕉果皮的混合样品作为样品材料，香蕉基因组作为对照，进行两个独立生物学重复的DAP-Seq实验，鉴定MaNAC25和MaNAC28蛋白在香蕉全基因组水平上的结合位点。

进一步地，所述DAP-Seq实验包括以下步骤：

S1、提取香蕉果皮的基因组DNA；

S2、将基因组DNA进行片段化处理和纯化处理后，测序构建基因组DNA文库；

S3、将冷响应转录因子的编码序列克隆到表达载体中构建融合蛋白，捕获表达的蛋白质；

S4、将蛋白质与衔接子连接的基因组DNA片段结合，重悬后进行PC R反应，纯化和筛选PCR产物并重悬，洗脱的DNA片段进行测序建库。

进一步地，所述鉴定方法包括步骤S5、将DAP-Seq测序读段映射到香蕉基因组序列，检测相对于基因组对照的MaNAC25和MaNAC28的富集峰，分析MaNAC25和MaNAC28目标基因的富集基序。