[发明专利]全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法

说明书

本发明公开一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法。本发明将全类型生物样本与蛋白裂解液按照100μL～500μL的体系进行充分混合，裂解提取蛋白，蛋白裂解液为0.1～10％脱氧胆酸钠；加入终浓度为10‑1000mM的还原烷基化试剂；根据样品蛋白量与蛋白酶质量比1：5～10的比例加入蛋白酶；将酶解后的肽段‑酸性终止液溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的固相萃取板，加入质量分数为1％的三氟乙酸异丙醇溶液、质量分数为0.2％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，加入碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液；滤液冻干复溶后，待质谱检测分析；本发明的蛋白酶切方法适用于多种生物样品，具有较广泛的适用性。

技术领域

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体涉及一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法。

背景技术

蛋白质组学(proteomics)，是以蛋白质组为研究对象，研究血清、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。蛋白质组学指在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，血清代谢等过程的整体而全面的认识。在过去的二十年中，质谱(MS)已成为高可信度和深度覆盖地定量生物样品中蛋白质的首选方法，它极大地促进了对血清信号转导网络的理解，阐明了蛋白质在不同生理病理状态下的相互作用，改善了对疾病机理的诊断和分子理解。随着蛋白质组学技术的研究发展，蛋白质组学已广泛地应用于分子系统生物学，临床研究和个性化医学等领域。

高通量蛋白质组学是大规模蛋白质表征的核心技术。随着生物医学研究领域对大型队列蛋白质组分析需求的增加，高通量蛋白质组分析已成为亟待解决的关键问题。因此如何快速提高检测通量成了目前组学的重点研究方向之一。

CN 114354333 A公开了一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法，一方面，每孔PVDF膜只可以吸附20-25μg蛋白，因此该方法的处理对象为微量样本，一般限于尿液，另一方面，由于该方法采用PVDF膜来结合蛋白，前处理流程中使用到的裂解液会对PVDF膜吸附蛋白的效率会产生不同的抑制作用，因此需要探索最佳的裂解液，因此，上述现有方法具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，以解决现有技术具有一定的局限性的问题。

本发明提供一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，蛋白裂解：基于自动化处理工作站，将全类型生物样本与蛋白裂解液按照100μL～500μL的体系进行充分混合，裂解提取蛋白，其中，所述蛋白裂解液为0.1～10％脱氧胆酸钠；

步骤二，还原烷基化：加入终浓度为10-1000mM的还原烷基化试剂，打开蛋白结构中二硫键并与蛋白游离巯基结合，暴露出尽可能多的酶切位点；

步骤三，蛋白酶解：根据样品蛋白量与蛋白酶质量比1：5～10的比例混合，将蛋白酶解成多个小的肽段；

步骤四，肽段脱盐：将酶解后的肽段-酸性终止液溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的固相萃取板，加入质量分数为1％的三氟乙酸异丙醇溶液和加入质量分数为0.2％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，最后加入碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，以得到进行质谱检测进样的样品；

步骤五，冻干复溶：滤液冻干复溶后，待质谱检测分析。

进一步地，所述步骤二中，所述还原烷基化试剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐、氯乙酰胺。

进一步地，所述步骤三中，所述蛋白酶为胰蛋白酶和赖氨酸酶。

进一步地，所述步骤一中，蛋白裂解的时间为5分钟；所述步骤二中，还原烷基化的时间为30分钟；所述步骤三中，蛋白酶解的时间为120分钟；所述步骤四中，肽段脱盐的时间为30分钟；所述步骤五中，冻干复溶的时间为40分钟。