[发明专利]一种表达沉默PD-L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种表达沉默PD‑L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。本申请的溶瘤腺病毒Ad‑E1M‑RGD‑shPDL1同时具有E1B55KD的缺失和E1A的Rb结合位点的突变，消除了腺病毒与p53和Rb蛋白结合的能力，可在p53功能异常和/或Rb传导途径异常的肿瘤内复制，同时限制了其在正常细胞内的复制，对正常细胞更安全。另外，在病毒的纤维部分连接RGD肽链，建立了整合素依赖的感染，对CAR阴性和阳性的癌细胞均显示强大的感染能力、复制能力和溶瘤效果。在病毒E1A启动子上插入PD‑L1的shRNA，抑制肿瘤细胞PD‑L1的表达从而提高抗肿瘤免疫效果，达到溶瘤免疫双重效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种表达沉默PD-L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。

背景技术

癌症的发病率逐年上升，早期癌有治愈可能，然而中晚期癌即使采用手术，放化疗，分子靶向药物及免疫治疗仍然无法治愈，需要开发新的治疗方法。

溶瘤腺病毒可以选择性地在肿瘤细胞内复制并破坏肿瘤而正常细胞不受影响，被认为是一种新型的抗肿瘤药物。其具有肿瘤选择性复制的理论基础是：腺病毒的复制需要细胞周期进入S期，腺病毒感染细胞后，其早期蛋白E1A与宿主细胞的 RB蛋白结合，激活E2F转录因子，迫使细胞周期进入S期，从而为腺病毒的复制提供了良好的环境。但是随着E2F的激活，p53也被激活。P53蛋白使细胞周期阻止在G1期或诱导细胞凋亡，从而限制了病毒的复制。然而腺病毒的E1B55KD蛋白可以结合并使p53蛋白失活，最终使细胞周期进入S期，从而使腺病毒能够在宿主细胞内复制。因此，E1B55KD缺失的腺病毒不能结合并失活p53蛋白，因而在p53 功能正常的细胞如正常细胞内不能复制，然而在p53功能异常的细胞，如肿瘤细胞内可以复制。溶瘤腺病毒感染癌细胞并在其内大量复制，致使癌细胞溶解并释放出大量病毒，释放出的病毒可再次感染临近组织细胞，如此反复循环，每一次循环病毒滴度都会成千上万倍地增加，直至肿瘤完全被破坏，被认为是治疗肿瘤有前途的手段。

Bischoff等1996年首先报道了E1B55KD缺失的溶瘤腺病毒dl1520(又叫做 ONYX-015)能选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞内复制并破坏肿瘤细胞，而在正常细胞内不能复制。但ONYX-015临床试验用于头颈部癌的治疗没有临床获益而终止。我国学者构建了与ONYX-015相似的溶瘤腺病毒安柯瑞(H101:E1B 55KD缺失)用于治疗头颈部鳞癌显示了满意的客观反应率,安柯瑞于2005年被我国食品药品监督管理局获批上市,这是世界上第一个上市的溶瘤病毒。自2000年，国际上报道了以Rb传导途径异常的肿瘤为靶向变的溶瘤腺病毒dl922-947、Delta-24(E1A与Rb 结合位点的突变消除了病毒与细胞Rb的结合)和CG0070(嵌入了E2F启动子可以靶向Rb异常的肿瘤)。CG0070膀胱内灌注治疗非肌层浸润性膀胱癌的二期临床试验显示了满意的疗效,目前正在进行三期临床试验。Delta-24-RGD(腺病毒链接RGD结构, 可以增强感染效率)治疗脑胶质瘤的一、二期临床试验正在进行。尽管E1A或E1B 单一突变的溶瘤腺病毒已经进入临床试验阶段，但有研究表明：E1A或E1B单一突变的腺病毒在正常细胞内仍有一定程度的复制，导致对正常细胞的毒性。另外，免疫检查点抑制剂广泛用于恶性肿瘤的治疗，但单独使用其客观反应率不足30％，大多数有反应的患者在使用免疫检查点抑制剂后，即使初期很有效，但没有表现出持久的缓解。现有的基于抗体的药物通过构象阻断细胞表面上的PD-L1起作用，但是最近的研究表明PD-L1并非全部存在于细胞表面，也存在于细胞内，并且可以通过循环重新填充到细胞膜上。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种表达沉默PD-L1基因的E1A/E1B 双突变溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。

本申请是采用以下技术方案得以实现的。

一种表达沉默PD-L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒，所述腺病毒E1A与 RB结合位点两个氨基酸替换突变、E1B55KD缺失、纤毛部分链接RGD、E1A启动子插入CD274的shRNA。