[发明专利]将单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞的方法

说明书

间充质干细胞(MSC)在细胞治疗和再生医学领域中具有广阔的应用前景。在本发明中，我们公开了一种新型的直接重编程方法用以制备诱导性间充质干细胞(iMSC)，通过利用游离型载体过表达五种重编程因子OCT4、SOX9、MYC、KLF4和BCL‑XL，可以直接将人外周血来源的单个核细胞(PBMC)重编程为诱导性间充质干细胞(iMSC)。经验证，重编程后的细胞能够表达典型的间充质干细胞表面标志物，并具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的三系分化潜能。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种将人外周血来源的单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)在再生医学和细胞治疗领域有重要应用前景，其治疗效果在全球范围内的1300多项临床试验中已经得到了可靠的验证。然而，由于细胞异质性、效力不均一、数目有限以及在体外扩增过程中细胞衰老较快，其在临床应用中仍然面临许多争议和挑战。因此，建立一种可产生大量效力一致的MSC尤其是自体MSC的方法，并使用可靠的分子标志物进行质量控制，将大大有益于促进MSC在临床中的应用。

外周血细胞目前已被广泛应用于重编程产生诱导性多能干细胞(iPSC)，究其原因可总结为以下两点：一是采血过程简单便捷，且创伤较小，使得血液成为人体中最容易获得的细胞来源；二是与成纤维细胞相比，血细胞不太可能产生由环境损伤引起的基因突变，从而具有潜在的安全优势。细胞重编程常用的逆转录病毒载体或慢病毒载体可能会引起插入突变，从而带来安全问题。游离型载体是非整合性质粒，目前已成功用于将成纤维细胞或血细胞重编程为无转基因和无病毒元件的iPSC，将重编程细胞连续培养约5代后，游离型质粒成分就已检测不到。在之前的研究中，为了提高血细胞中重编程因子的表达，我们对游离型载体进行了结构修饰，包括使用脾脏病灶形成病毒启动子(SFFV)和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)，使细胞重编程效率提高了10到100倍。

基于过去对细胞重编程方法的研究，OCT4已被认定是将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的关键因子。我们之前报道了用修饰的游离型载体瞬时过表达OCT4可直接将人脐血来源的CD34⁺细胞重编程为具有三系分化潜能的诱导性间充质干细胞(iMSC)。基于脐带血来源有限，我们也试图构建一种新型的利用游离型载体将人外周血来源的单个核细胞(PBMC)重编程为iMSC的方法。

我们首先尝试使用临床相关的载体系统单独过表达OCT4是否能将人PBMC重编程为iMSC。我们将分离得到的人PBMC在红细胞培养基中培养六天以扩增红系祖细胞，之后用改进的基于oriP/EBNA1的游离型载体对扩增得到的2x10⁶个细胞进行核转染，该载体在强SFFV启动子下可表达OCT4，再将细胞在添加重编程小分子的MSC培养基中进行培养。但连续培养两周后我们依然没有观察到任何类似MSC的集落形成，这表明单独过表达OCT4不足以将人PBMC直接重编程为iMSC。因此，早期针对人脐血来源的CD34⁺细胞重编程为iMSC的方法不再适用于人外周血，亟需开发新型的可将人外周血来源的PBMC直接重编程为iMSC的方法。

发明内容

本公开提供了一种将人外周血来源的单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞的方法，且重编程后的细胞能够表达典型的MSC表面标志物，同时具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的三系分化潜能。本发明至少在一定程度上解决了将人外周血来源的PBMC直接重编程为iMSC。

本公开的其他特性和优点将通过下面的详细描述变得显然，或部分地通过本公开的实践而习得。

在本公开的一个实施例中，所述单个核细胞来源于人体外周血。

在本公开的一个实施例中，重编程载体为游离型质粒载体，也可使用其他可替代的非整合型载体。

在本公开的一个实施例中，重编程载体的骨架来自EBNA/oriP游离型载体质粒。