[发明专利]制备L-酪氨酸的重组菌及制备方法

说明书

本发明公开了制备L‑酪氨酸的重组菌及制备方法，属于生物工程技术中的重组菌领域。本发明还提供重组菌的制备方法，所述方法包括将乙醇酸氧化酶和所述酪氨酸酚裂解酶的编码基因导入受体菌，得到表达所述乙醇酸氧化酶和所述酪氨酸酚裂解酶的重组菌。本发明构建的重组菌以L‑乳酸和苯酚为原料，实现了L‑酪氨酸的高效生产。与现有技术中以L‑丙氨酸或丙酮酸为底物的制备方法相比，成本投入更低；中间产物丙酮酸直接参与到后续反应中，无中间产物堆积现象。本发明的全细胞转化生产L‑酪氨酸的方法，简化了工艺、提高了生产效率、成本低，具有重要的工业应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术中的重组菌领域，具体涉及制备L-酪氨酸的重组菌及制备方法。

背景技术

L-酪氨酸(L-tyrosine，L-Tyr)，是一种重要的营养必需氨基酸，对人和动物的新陈代谢、生长发育起着重要的作用，广泛应用在食品、饲料、医药和化工等行业。其常作为苯丙酮尿症患者的营养补充剂，以及多肽类激素、抗生素、L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。

目前，L-酪氨酸的生产方法主要有三种：一是蛋白质水解法，但是由于其对环境的污染较大，已经逐渐被淘汰；二是发酵法，发酵培养大肠杆菌工程菌利用葡萄糖为原料从头合成L-酪氨酸的产率较低，目前无法与提取法及酶法竞争；三是酶催化法，以苯酚、丙酮酸、氯化铵为原料，再利用酶催化发生产L-酪氨酸，例如申请号为201610511684.0的专利，用丙酮酸、苯酚和氯化铵加入β-酪氨酸酶进行酶催化反应，该方法也利用等电点提取，收率高，纯度高，但丙酮酸市售价格约为九万元每吨，成本高，投入工业生产后经济价值较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何高效地制备L-酪氨酸。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种重组菌，所述重组菌能利用L-乳酸和苯酚制备L-酪氨酸。

进一步地，上述的重组菌中，所述重组菌表达乙醇酸氧化酶和酪氨酸酚裂解酶。

进一步地，上述的重组菌中，所述乙醇酸氧化酶选自下述a1)-a3)中任一种蛋白质：

a1)、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

a2)、将a1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有乙醇酸氧化酶活性的蛋白质；

a3)、在a1)或a2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述酪氨酸酚裂解酶选自下述a4)-a6)中任一种蛋白质：

a4)、氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质或氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质或氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；

a5)、将a4)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有酪氨酸酚裂解酶活性的蛋白质；

a6)、在a4)或a5)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。

表1：标签的序列