[发明专利]一种仅具有RNA靶切割活性的原核Argonaute蛋白质在RNA编辑中的应用

说明书

本发明公开了一种仅具有RNA靶切割活性的原核Argonaute蛋白质在RNA编辑中的应用，所述Argonaute蛋白质来源于中温原核生物Verrucomicrobia bacterium，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或为与SEQ ID NO:1相似度极高且具有相同功能的蛋白质；该蛋白质对单链向导DNA具有结合活性，并且仅仅只对与单链向导DNA互补配对的RNA靶具有核酸酶活性，故可利用该蛋白质进行体内外靶向RNA编辑，为RNA编辑提供了一个全新的有力工具。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种原核生物来源的仅具有RNA靶切割活性的原核Argonaute蛋白质在体内或体外的RNA编辑中的应用。

背景技术

目前，真核生物来源的Argonaute蛋白质(简称eAgos)能够在常温条件下催化RNA向导(gRNA)引导的RNA切割反应，并在RNA干扰(RNA interference，RNAi)途径中发挥至关重要的作用。原核生物来源的Argonaute蛋白质(简称pAgos)相比eAgos功能和结构更加多样化，但其生理功能长期以来难以捉摸。早期研究主要集中于高温生物来源的pAgos，除了Marinitogapiezophila来源的MpAgo偏爱利用5’末端羟基化(5’OH)的向导RNA(gRNA)切割靶单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)和RNA靶之外，其余高温来源的pAgos都偏爱利用5’末端磷酸化(5’P)的向导DNA(gDNA)切割ssDNA靶和/或RNA靶。然而高温生物来源的pAgos在中温条件下都只有低水平的gDNA引导的ssDNA靶和/或RNA靶切割活性，这限制了基于pAgos的基因编辑和RNA编辑技术的应用开发。最近的研究聚焦于中温生物来源的pAgos，以期找到能够在中温条件下有效切割DNA靶和/或RNA靶的pAgos。然而，几乎所有已经表征的中温pAgos都偏爱在中温下在gDNA的引导下切割DNA靶，鲜有报道能够有效切割RNA靶的pAgos。嗜盐古菌Natronobacteriumgregory来源的NgAgo可以在常温下在gDNA的引导下切割RNA靶，但它的切割位点尚不确定，且并未证明能切割具有高级结构的RNA。中温细菌Kurthiamassiliensis来源的KmAgo可以在gDNA和gRNA引导下切割DNA靶和RNA靶，但更加偏爱切割DNA靶。耐冷细菌Mucilaginibacterpaludis来源的MbpAgo偏爱在gDNA引导下切割RNA靶，但仍保留有切割DNA靶的活性。迄今为止，还未报道能专一性切割RNA靶的pAgos。

长期以来，人们广泛关注靶向RNA的可编程核酸内切酶，因为这类酶可以应用于RNA结构功能研究、核酸检测领域、RNA纳米技术和RNA治疗等领域。目前使用的方法都存在一定的局限性。成簇的规律间隔的短回文重复序列相关系统(CRISPR-Cas)是目前用于可编程核酸切割的最广泛的酶工具，新近发现的CRISPR-Cas13核酸酶正迅速应用到多个领域，包括RNA编辑、病毒清除、核酸检测。但CRISPR-Cas核酸酶需要gRNA向导，而RNA主要通过体外转录和纯化制备，或者通过化学合成，成本较高；此外，该类核酸酶尚未显示出识别结构化的RNA元件的功能。有的eAgos也能够在gDNA的引导下在中温切割几乎所有类型的RNA，但大多数动植物细胞内存在RNAi途径，这些eAgos可能会干扰细胞本身的RNAi功能，这阻碍了将eAgos应用于细胞内的RNA编辑。而原核生物体内不存在RNAi途径，因此pAgos可能不会影响细胞本身的RNAi功能。因此，RNA编辑领域仍然存在对能在常温条件下发挥作用并能应用于动植物细胞的RNA编辑的pAgos的迫切需求。