[发明专利]一种基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法

权利要求书

1.一种基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)SCDB微球的设计与制备；

(2)SCDB-seq的设计与使用；

(3)基于SCDB-seq的空间转录组测序的设计与实现。

2.根据权利要求1所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤(1)的设计方法如下：使用两段具有特定序列设计的引物：引物1-N(1≤N≤8)、引物2-M(1≤M≤12)采用均分组合制备方法在微球表面进行DNA条码引物制备，将一定量的编码微球均分为8份分别放入离心管并命名为1-N(1≤N≤8)，向离心管中加入对应引物1-N进行第一轮编码，随后将8支离心管中的微球按照特定顺序，即离心管1-1～1-8对应96孔PCR板上的A～H排，均分至一块96孔PCR板中加入对应引物2-M进行第二轮编码，最终生成96种具有独特DNA条码组合的编码微球。

3.根据权利要求2所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，其特征在于：使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)将微球表面的羧基基团转换成可与氨基反应的O-酰基异脲中间体，该中间体能够迅速与5’端修饰有氨基基团的引物1-N形成酰胺键，将引物1-N共价固定在微球表面，引物2-M的3’末端可与引物1-N的3’末端产生反向互补，随后在等温扩增DNA聚合酶的作用下将引物2-M中的序列反向互补延伸到引物1-N的3’末端，从而完成微球表面编码引物的制备。

4.根据权利要求2所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，其特征在于：所述引物1-N序列设计，即5’→3’，为：1)PCR引物，用于通过PCR扩增cDNA文库；2)DNA条形1-N，起到DNA编码作用的特异条码序列，共8种；3)连接序列，用于与引物2-M3’末端反向互补；所述引物2-M序列设计，即5’→3’，为：1)poly-dA，用于生成具有mRNA捕获功能poly-dT；2)UMI^*，起到特异性分子识别作用的序列；3)DNA条形2-M^*，起到DNA编码作用的特异编码序列，共12种；4)反向互补连接序列，用于与引物1-N3’末端反向互补。

5.根据权利要求2所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，其特征在于：所述微球为单分散磁性微球，微球内核为SiO₂或聚苯乙烯，内核外覆盖有一层Fe₃O₄表面包裹有修饰为羧基的化学修饰层。

6.根据权利要求5所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，其特征在于：所述微球的粒径大小为0.1μm至100μm。

7.根据权利要求1所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中SCDB-seq的设计方法，包括如下步骤：

(1)使用SCDB微球对样本中的mRNA进行捕获；

(2)对捕获到的mRNA分子进行逆转录；

(3)通过PCR扩增构建满足第二代测序的cDNA文库；

(4)使用纯化磁珠富集目标cDNA片段。

8.根据权利要求1所述的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中基于SCDB-seq的空间转录组测序的设计，包括如下步骤：

(1)应用于新鲜冰冻组织切片的实验方案在mRNA捕获环节增加了0.5％浓度的TritonX-100以透化细胞膜，使mRNA得以从细胞中充分释放且被SCDB微球捕获；

(2)应用于FFPE组织切片的实验方案除增加0.5％浓度的Triton X-100外，由于FFPE组织切片内的mRNA已存在一定程度的降解，故取消了用于使mRNA发生片段化的Mg²⁺热处理环节，且在mRNA释放及捕获环节添加0.125μg/μL浓度的蛋白酶K并在60℃下进行1h的孵育，充分去除FFPE组织中存在的分子间交联，释放出mRNA分子；

(3)在cDNA测序文库构建过程中，使用96种SCDB微球与12种P7 indexed引物相结合，使SCDB-seq单次实验检测通量达到1，152。