[发明专利]一种基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法

说明书

本发明公开了一种基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，包括如下步骤：基于均分组合理念的DNA编码微球的设计与制备；基于SCDB微球的转录组测序文库构建(SCDB‑seq)的设计；基于SCDB‑seq的空间转录组测序的设计与实现。本方法可以以单细胞分辨率(～10μm)对新鲜冰冻样本切片和福尔马林固定石蜡包埋样本切片上的微区进行可选择性的、高多路复用性的中通量(50～1000样本)空间转录组测序文库构建，能够可以选择性地获得组织切片中多个特定微区样本的基因表达谱；本方法实验操作量和试剂成本仅为已有同类方法的～1％和～13％，展现出良好的人力和试剂成本控制。

技术领域

本发明涉及单细胞转录组测序、空间转录组测序的NGS测序cDNA文库构建方法，特别涉及一种可以适配于激光显微切割(Laser capture microdissection，LCM)、激光诱导前向转移(Laser-induced forwardtransfer，LIFT)以及微区采样等组织切片微区样本采集方法的中等检测通量(50～1000个)、高多路复用性的转录组测序文库构建方法。

背景技术

基于NGS的空间分辨转录组技术利用带有oligo-dT的引物对目标微区内的mRNA进行捕获，随后应用某种RNA-seq方案进行逆转录及cDNA扩增以得到满足测序要求的cDNA文库。现有的基于NGS的空间分辨转录组技术多直接应用与其检测通量相当scRNA-seq方案的cDNA文库构建方法或其改进版本，例如在基于原位捕获的高通量方法中：ST、HDST应用InDrop中的建库测序方案，即cDNA合成后通过IVT进行线性扩增，随后进行二次逆转录并通过PCR扩增得到测序文库以实现对低丰度转录本的高并行、高灵敏度检测，slide-seq、DBiT-seq采用Drop-Seq中的方案，即一种基于Smart-seq2方案、针对高通量检测进行改进的版本，在逆转录过程中仍进行模板转换及两轮PCR扩增，但Tn5转座酶打断后对仅3’端DNA片段进行扩增以保留DNA条形码和UMI的序列；在基于显微切割的空间分辨转录组方法中：Geo-seq、LCM-seq直接使用Smart-seq2的逆转录及cDNA文库构建方案，以对目标微区内的mRNA分子进行全长测序。

随着各种显微切割、微区采样技术的发展，对单个目标区域进行采样所需的时间不断缩短且自动化程度持续提升，具有对一组组织切片内成百上千个目标微区进行连续取样的潜力。但目前此类技术仅能依靠Smart-seq2进行测序文库构建，Smart-seq2方案无法使用具有DNA条形码的捕获引物，仅能在PCR扩增建库过程中通过不同的index序列进行特异性标记。因此Smart-seq2是一种低通量、低并行性的全长转录本测序方案(多针对几个或几十个微区样本)。在文库构建过程中，各微区样本无法在逆转录后混合进行并行建库测序，导致实验操作量及试剂消耗量与采集微区样本数成正比，限制了基于显微切割的空间分辨转录组方法对组织切片内目标区域进行中通量(50～1000样本数)、高并行性基因表达谱检测，阻碍了此类技术应用于明确生物组织内区域特异性基因表达谱和细胞集体行为。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种检测效果好、成本低、可选择性的、高多路复用性的基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，

技术方案：所述基于均分组合编码微球的空间转录组测序文库构建方法，包括如下步骤：

(1)基于SCDB微球的设计与制备；

(2)SCDB-seq的设计与使用；

(3)基于SCDB-seq的空间转录组测序的设计与实现。