[发明专利]一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法

权利要求书

1.一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1)、构建重组猪α干扰素的克隆载体，根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性和GC含量得到优化的猪的α干扰素poIFN-α；

S2)、E.coli TOP10F’工程菌的获得；

S3)、重组表达载体的构建

S301)、根据含密码子优化后的猪α干扰素poIFN-α的核苷酸序列，设计上下游引物，在5’端引物的上游加入XhoI和AAA AGA核苷酸序列，在3’端下游加入终止密码子和EcoRI酶切位点；

上游引物为：5’CCG GAATTC AAAAGATGTGATCTACCTCAGA

下游引物为：5’CCG CTCGAG CTATTATTCTTTTTTTCTC

S302)、将合成的目的基因片段插入到pUC18克隆质粒上，以pUC18-poIFN为模板，以上、下游引物为引物；

S303)、目的基因片段与质粒的连接；

S304)、构建的重组质粒的鉴定；

S305)、重组质粒经酶切线性化处理；

S4)、将线性化产物导入表达宿主菌；

S401)、毕赤酵母感受态细胞的制备；

S402)、将线性化质粒电转化毕赤酵母感受态细胞；

S403)、重组菌株的抗性筛选；

S404)、重组酵母菌的鉴定以及高拷贝的筛选；

S5)、高拷贝重组酵母菌的诱导表达

S501)、高表达菌株的初筛；

S502)、高表达菌株的复筛。

2.根据权利要求1所述的一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤S2)中，所述的E.coli TOP10F’工程菌的获得如下：

取37℃振荡培养过夜的E.coli TOP10F’菌种，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

第二天取0.1％接种量重新转接LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h；冰浴30min后；

冰浴后，4℃，4000rpm离心10min收集菌体，用预冷的0.1M CaCl₂溶液悬浮细胞，再次离心收集细胞，再次用用预冷的0.1M CaCl₂溶液悬浮细胞，得到E.coli TOP10F’感受态细胞。

3.根据权利要求1所述的一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤S303)中，目的基因片段与质粒的连接如下：

选用pGAPZαA(Invitrogen)质粒，用XhoI和EcoRI双酶切使之线性化后；将同样用XhoI和EcoRI双酶切的猪α干扰素的目的DNA与XhoI和EcoRI双酶切的线性化pGAPZαA(Invitrogen)质粒连接，然后转化大肠杆菌菌株TOP10F’，得到的重组质粒pGAPZαA-poIFN。

4.根据权利要求1所述的一种猪α干扰素重组基因工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤S401)中，毕赤酵母感受态细胞的制备如下：

S411)、接种酵母受体菌，取少许菌悬液活化接种到YPD平板上，30℃培养2d；

S412)、挑取平板上的单菌落接种于5mL YPD培养基中，30℃摇床震荡培养过夜；

S413)、过夜培养后按照0.1％-2％比例接种量接种到100mL YPD培养基中，30℃摇床震荡培养至OD₆₀₀为1.2-1.5；

S414)、4℃，1500g离心5min收集菌体沉淀，用100mL预冷的无菌水重悬菌体；

S415)、再次4℃，1500g离心5min收集菌体沉淀，用100mL预冷的无菌水重悬菌体；

S416)、4℃，1500g离心5min收集菌体沉淀，用20mL预冷的1M山梨醇洗涤菌体；

S417)、将菌体重悬于1mL1M山梨醇中，放于冰上，待转化；感受态细胞不可放于-80℃冰箱冷冻保存。